作者：李怡芳，曾怀苇，王敏，何蓉蓉，栗原博
【摘要】 目的 探讨金针菇多糖(polysaccharides of flammulina velutipes, fvp)对ccl4诱导的急性肝损伤的保护作用。方法 小鼠腹腔注射ccl4橄榄油溶液(0.5%,5 ml·kg-1)12、24、48、72 h后测定血清alt，确定ccl4急性肝损伤造模最佳时间为24 h。 fvp (75,150,300 mg·kg-1)连续口服给药8 d，第7天采用ccl4制备小鼠急性化学性肝损伤模型，24 h后测定fvp对血清alt、ast活性，肝匀浆sod活性、mda含量的影响。结果 fvp能显著降低ccl4致急性肝损伤小鼠血清alt、ast活性，提高肝匀浆sod的活性,降低mda的含量。结论 金针菇多糖对ccl4诱发的小鼠应激性肝损伤有一定的保护作用。
【关键词】 金针菇多糖(fvp);肝损伤;ccl4;alt;ast;mda;sod
abstract:objective the study was designed to investigate the protective effect of polysaccharides of flammulina velutipes (fvp) against liver injury induced by ccl4. methods when mice were intraperitoneally injected with olive solution(0.5%,5 ml·kg-1)for 12,24,48,72 h,the plasma alt activities were determined and the best time for ccl4induced acute liver injury in mice was 24 h. fvp (75,150 and 300 mg·kg-1) were orally administered to mice in experimental groups once per day for 8 days. on the seventh day,all mice were intraperitoneally injected with ccl4 to induce acute liver injury. 24 hours later,all mice were sacrificed,and blood and liver were collected for measurements of alt and ast levels,the content of mda and the activities of sod. results oral administration with fvp significantly reduced the elevated levels of alt and ast in mice with ccl4induced acute liver injury. the sod level and the elevated content of mda were lowered. conclusion polysaccharides of flammulina velutipes had the protective effect against ccl4induced acute liver injury in mice.
key words:polysaccharides of flammulina velutipes (fvp),liver injury,ccl4,alt,ast,mda,sod
金针菇 (flammulina velutipes) 属担子菌亚门、金钱菌属，是一种食药兼用菌，含有多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、朴菇素等多种生物活性物质[1]，具有较高的药用价值[2,3]。wWw.11665.cOm金针菇功能蛋白性蛋白诸如核糖体失活蛋白(robosome inactitating proteins,rip)具有抗肿瘤、抗病毒、抗虫、抗真菌以及抗人免疫缺陷病毒(hiv) 等活性;真菌免疫调节蛋白(fungal immunomodulatory proteins,fip) 具有抗癌、抗过敏、抗增殖、刺激免疫细胞产生多种细胞因子和免疫调节功能;金针菇毒素(flammutoxin,ftx) 具有引起哺乳动物红细胞裂解，使肿瘤细胞溶胀破裂，改变肠上皮细胞的渗透性，促进药物吸收等作用[4-8]。近年来，金针菇中另一种重要的生物活性物质即金针菇多糖(polysaccharides of flammulina velutipes,fvp)也引起人们的关注。研究发现，金针菇多糖有抗肿瘤[9-11]、免疫调节[12,13]和一定的保肝作用[14，15]。ccl4是一种常见的环境污染源和肝脏毒性物质，ccl4肝损伤是经典的急性化学性肝损伤动物模型，也是目前肝病研究的重要模型之一。本实验通过建立ccl4小鼠急性肝损伤模型，进一步探讨金针菇多糖对肝损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 金针菇多糖(fvp)提取物由广州农业 科学 院提供;联苯双酯滴丸(bdp)，广州星群药业股份有限公司，生产批号：ef40131;谷丙转氨酶(alt)、 谷草转氨酶(ast)、超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为：20070713，20070713，20080513，20080513。
1.2 动物 昆明种小鼠,雄性,体质量(20±2) g,由南方医科大学动物中心提供，合格证号： scxk(粤)20032002，饲养温度(23±2) ℃，饲养1周后进行实验。
1.3 仪器 318k型台式高速离心机(sartorius,germany);mk3型酶标仪(labsystem,helsinki,finland);bs210s 电子 分析天平 (sartorius,gttingen,germany);wh861型漩涡混合器(太仓市科教器材厂);ph s25型酸度计(上海伟业仪器厂);ultraturrax t8型组织匀浆机(ika labortechnik,staufen,germany);wh861型漩涡混合器(太仓市科教器材厂)。
1.4 方法
1.4.1 ccl4急性肝损伤的造模时间 将小鼠随机分成5组，每组10只，分别为：正常对照组、急性肝损伤组1(造模时间为12 h)、急性肝损伤组2(造模时间为24 h)、急性肝损伤组3(造模时间为48 h)、急性肝损伤组4(造模时间为72 h)。各急性肝损伤组均腹腔注射ccl4橄榄油溶液(0.5%,5 ml·kg-1)，并分别于造模后12 h、24 h、48 h、72 h乙醚麻醉并心脏取血。正常对照组则腹腔注射等体积的橄榄油后乙醚麻醉取血。用赖氏法测定血浆alt水平，对比各时间点alt值随时间的变化关系以确定最佳造模时间。
1.4.2 小鼠急性肝损伤模型的建立 将小鼠随机分成6组，每组10只：正常对照组、模型组、阳性药组(联苯双酯150 mg·kg-1)、低剂量组(75 mg·kg-1)、中剂量组(150 mg·kg-1)、高剂量组(300 mg·kg-1)。除空白对照组外，其余各组均每日灌胃1次，连续8 d，第7天下午模型组和给药组腹腔注射ccl4橄榄油溶液(0.5%,5 ml·kg-1)，正常对照组则灌胃给同等体积蒸馏水和腹腔注射同等体积橄榄油。在造模期间，所有小鼠禁食不禁水。24 h后乙醚麻醉小鼠心脏取血和剥离肝脏。
1.4.3 血浆alt和ast活性的测定 小鼠全血置于肝素处理过的离心管中，以5 000 r/min离心5 min分离血浆。采用赖氏法[16],按照alt试剂盒说明书中的步骤进行操作测定血浆alt活性。
1.4.4 肝脏sod活性的测定 小鼠肝组织的5%生理盐水匀浆液在4 ℃条件下以10 000 r/min离心10 min,取上清液稀释成体积分数为2%后以考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量。采用黄嘌呤氧化酶法[17]，按照sod试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝匀浆中sod的活性。
1.4.5 肝组织mda含量的测定 小鼠肝组织的5%生理盐水匀浆液在4 ℃条件下以10 000 r/min离心10 min,取上清液稀释成体积分数为2%后以考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定蛋白含量。采用tbars比色法[18],按照mda试剂盒说明书中的步骤进行操作以测定小鼠肝组织匀浆中mda的含量。
1.5 统计学处理 实验数据以(±s)表示，采用spss软件，利用anova检验进行统计学处理，p< 0. 05有统计学意义。
2 结果
2.1 ccl4急性肝损伤的造模时间 如表1所示，与正常对照组alt (29.67±1.25) u·l-1相比，小鼠腹腔注射ccl4橄榄油溶液后，血浆alt值随造模时间的变化而变化(12 h、24 h、48 h、72 h)，其中造模24 h后alt达最高值(117.87±11.86)u·l-1，而12 h和48 h (78.21±9.78,94.55±4.57) u·l-1相对正常组有升高,但比24 h低，72 h后alt(40.01±9.12) u·l-1趋近正常小鼠血清alt。
2.2 金针菇多糖对急性肝损伤小鼠血浆alt和ast的影响 如表2所示，与正常对照组相比，模型组小鼠血浆alt和ast水平显著升高(p< 0.01)，表明ccl4成功诱导了小鼠急性肝损伤。阳性药组和fvp各剂量组较模型组相比均有显著降低(p< 0.01)，且呈剂量依赖性关系。
2.3 金针菇多糖对急性肝损伤小鼠肝组织中sod活性的影响 如表3所示，与正常对照组相比，模型组小鼠肝匀浆中sod活性显著降低(p< 0.01)。与模型组相比，阳性药组和fvp各剂量组肝匀浆中sod活性显著升高。
2.4 金针菇多糖对急性肝损伤小鼠肝组织中mda含量的影响 如表3所示，与正常对照组相比，mda含量显著增加(p< 0.01)。与模型组相比，阳性药组和fvp各剂量组肝匀浆中mda含量显著降低(p< 0.01)，且呈剂量依赖性关系。表1 ccl4造模后血清alt在不同时间点的变化表2 fvp对急性肝损伤小鼠血浆alt和ast的影响与正常对照组比较: ##p<0.01;与模型组比较: *p<0.05，**p<0.01表3 fvp对急性肝损伤小鼠肝组织sod活性和mda含量的影响与正常对照组比较: ##p<0.01;与模型组比较:**p<0.01
3 讨论
实验结果表明，小鼠腹腔注射ccl4 24 h后，血清alt值达到峰值，因此本实验在研究金针菇多糖对ccl4急性肝损伤时选择造模时间为24 h。ccl4肝损伤是经典的急性化学性肝损伤动物模型，也是目前肝病研究的重要模型之一。相关研究表明，ccl4诱导小鼠急性肝损伤的机制为ccl4经肝微粒体cytp450激活后产生了自由基(ccl3·或ccl3oo·)，这些自由基不仅攻击膜上的磷脂分子引起脂质过氧化反应产生mda等脂质过氧化产物，而且会与肝微粒体脂质和蛋白质发生共价结合，破坏肝脏细胞膜的结构，导致细胞内的转氨酶如alt、ast等释放进入血液。此外，它们还能抑制细胞膜和微粒体膜上钙泵的活性，使钙离子内流增加，造成肝细胞脂质过氧化反应[19]。本实验中，模型组小鼠血清alt、ast的活性显著升高，作为肝组织自由基清除剂的sod活性显著降低，而肝组织mda含量明显增多，表明ccl4诱导小鼠急性肝损伤模型建立。
实验结果表明，金针菇多糖对ccl4所致的小鼠血浆alt和ast活性升高有显著的降低作用，并明显升高肝脏sod的活性，显著降低脂质过氧化产物mda的含量，作用呈明显的量效关系。其作用机制可能为：金针菇多糖能提高抗氧化酶sod等的活性，从提高自由基清除能力，减少自由基对细胞膜的损害，防止脂质过氧化反应，可能通过诱导肝药物代谢酶的活性，使肝脏清除自由基的能力加强。最近研究表明，金针菇多糖具有一定的免疫调节作用，通过抑制kuffer细胞和中性粒细胞的活性以降低炎症损伤[20]，抑制nfκb、icam1等细胞因子的活性，以抑制炎症介质和白细胞的黏附和迁移,防止肝损伤加重[21]。其确切作用机理还有待于进一步探索。
【 参考 文献 】
[1] 柯丽霞,杨晓彤. 金针菇菌丝体糖蛋白(fmgp)的提取及理化性质[j].
