作者：潘雪丰，温彩霞，许建华
【摘要】 目的 对比油酸诱导肝癌细胞株hepg2、正常肝细胞株l02建立的肝细胞脂肪变性模型,通过检验复方蛋氨酸胆碱的防治作用，寻找简便、稳定的体外药物筛选模型。方法 设正常组、hepg2模型组、hepg2不同浓度给药组、l02模型组、l02不同浓度给药组、用油酸诱导肝细胞脂肪变,复方蛋氨酸胆碱干预，以油红o染色镜下观察细胞内脂滴形成状况,并检测细胞上清中的alt、ast、γgt水平。结果 油酸刺激hepg2、l02 肝细胞24 h,细胞内典型脂肪滴形成。复方蛋氨酸胆碱2次给药，药物难以使hepg2细胞内脂滴减少，l02细胞在加油酸48 h后油红o 染色证明细胞内脂滴可减少，脂滴表达的红色iod值，各给药组与模型组比较，差异有极显著性(p<0.01)。细胞上清液中alt、ast、γgt，复方蛋氨酸胆碱各组与模型组比较差异有显著性，证实其对肝细胞损伤较小。结论 l02比hepg2更适合作为体外的筛药细胞模型，油酸刺激l02细胞形成脂肪变，药物提前24 h干预，24 h后再给药1次，这种造模和给药方案可作为一种可行的脂肪肝细胞筛药模型使用。Www.11665.cOM
【关键词】 肝癌细胞株hepg2;l02肝细胞株;油酸;脂肪肝;模型;体外;复方蛋氨酸胆碱
abstract:objective to compare two models of hepatocytic steatosis in vitro，which were established by treating hepatocarcinoma cell hepg2 and human liver cell l02 with oleic acid in vitro. through examination the role of compound methionine and choline bitartrate,to find a convenient and stable model in vitro for drug screening.methods normal group,hepg2 model group,groups of hepg2 cells treated with compound methionine and choline bitartrate at different concentrations,l02 model group,and model groups of l02 cells treated with drug at different concentratrions were set up. the hepatocytic steatosis models were established by treating hepg2 and l02 with oleic acid in vitro. the fatty droplets in cells could be observed by oil red o staining under light microscope. alt,ast,and γgt in cell supernatant were detected by reactant kits.results after treated with oleic acid for 24 hours,the fatty droplets in cells were observed by oil red o staining under light microscope. with the prevention with compound methionine and choline bitartrate,the amount of lipid droplet in hepg2 cells did not decrease,but decreased in l02 cells after treated with oleic acid for 48 hours. compared with the model group,the integral optical density (iod) value of positive of red fatty droplets in the group treated with drugs decreased markedly (p<0.01). there were significant differences in alt, ast, and γgt in cell supernatant in the groups treated withcompound methionine and choline bitartrate and model groups,indicating that the damage to hepatocyte l02 was small.conclusion l02 cell line was more suitable in the developing of in vitro model of hepatocytic steatosis,the model with oleic oilinduced steatosis,intervened with compound methionine and choline bitartrate for 24 hours,and treated with oleic acid 24 hours later,the method could be used to develop an in vitro model of hepatocytic steatosis model for drug screen.
key words:hepatocarcinoma cell hepg2; human liver cell l02; oleic acid; fatty liver; model; in vitro; compound methionine and choline bitartrate
近年来,非酒精性脂肪性肝病(nafld)的发病率不断上升,由于它是肝硬化、肝癌的重要病因[1,2],已成为肝病领域的新挑战。目前对脂肪肝的研究主要采用的是动物模型，存在个体差异较大、实验条件不好控制、周期较长、材料耗费较多等缺点。而细胞模型实验却可以很好地克服上述缺点，不仅能针对性地探究细胞水平的脂肪肝发病机制，并且能有效地缩短筛选 治疗 药物的进程，有助于筛选大量的药物。
由于脂肪肝筛药细胞模型报道较少，本研究拟采用油酸作用于在体外培养的肝癌细胞hepg2[3]和人正常肝细胞(l02细胞株)[4]的方式，建立脂肪肝的体外模型，结合油红o染色观察细胞内脂肪滴变化情况，来验证该肝细胞是否产生脂肪变性，并观察复方蛋氨酸胆碱的防治作用，以期寻找简便、稳定的体外药物筛选模型。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株
人正常肝细胞(l02株)由中科院上海细胞研究所提供;人肝癌细胞株hepg2由福建医科大学临床药理研究所提供。
1.1.2 药物
复方蛋氨酸胆碱片(主要成分：蛋氨酸0.1 g、重酒石酸胆碱0.1 g、维生素b1 2 mg、维生素b2 2 mg、维生素b6 2 mg、泛酸钙3 mg、烟酰胺6 mg等)， 中国 通化东宝药业股份有限公司。
1.1.3 主要试剂和设备
油酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司;rpmi1640培养基，美国gibco公司;胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司;小牛血清，美国gibco公司;胰蛋白酶，美国 hyclone 公司;四甲基偶氮唑盐(mtt),上海华舜生物工程公司;油红o，国药集团化学试剂有限公司;丙氨酸氨基转移酶(alt)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)试剂盒、γ谷氨酰转肽酶(γgt)试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司。
a/b3 1285型超净工作台，美国forma公司;371型直热式二氧化碳培养箱，美国forma公司;550 型酶标仪，美国biorad公司;sd811l半自动生化仪，上海迅达医疗仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养方法 用6孔板将人肝癌细胞株hepg2、人正常肝细胞株 l02 接种于含 5%胎牛血清(fbs)、5%小牛血清的 rpmi 1640 培养液中，细胞培养同时放入盖玻片，使细胞贴壁于玻片上生长。置 37 ℃、5%co2饱和湿度孵育箱内培养。根据细胞生长情况，每2～3天用0.25%的胰蛋白酶消化，进行传代培养。
1.2.2 mtt实验筛选dmso、复方蛋氨酸胆碱作用浓度 将hepg2、l02细胞培养于96 孔板中,实验分别设空白对照组、复方蛋氨酸胆碱(dmso溶解)、dmso各3个实验组，每组均设3个平行孔。分别加入含不同浓度的dmso(表1)、复方蛋氨酸胆碱(表2),用mtt比色法测定细胞增殖情况(以吸光度a值表示),了解药物对细胞增殖的影响情况，实验重复3次。
抑制率ir(%)=(1-实验组平均a值/空白对照组平均a值)×100%
1.2.3 脂肪肝细胞模型的建立 接种hepg2、l02细胞24 h，待细胞贴壁生长后，设对照组、模型组。对照组：用rpmi 1640(含 5% 胎牛血清，5% 小牛血清)培养液培养;模型组：分别用含20、40、60、80、100、120 μg·ml-1的油酸及培养液培养;每组均设3个平行孔。培养 3 d，用油红o染色镜下观察细胞浆内变化。选择油酸作用最佳浓度，实验重复3次。
1.2.4 分组给药 将hepg2、l02细胞各分5组,对照组(用正常培养基)、模型组(油酸以dmso溶解，浓度由预实验确定)、给药组(复方蛋氨酸胆碱片以dmso溶解，200 μg·ml-1组、300 μg·ml-1组、400 μg·ml-1组，细胞培养24 h后给药1次，48 h后换液再给药1次)，细胞培养48 h后各组(除正常组外)，加入油酸造模。每组各3孔，观察48 h，实验重复3次。
1.2.5 细胞内脂滴形成的观察 将玻片从6孔板中取出，pbs液洗5 min×3次,4%多聚甲醛固定20 min。pbs液洗细胞2次，60%异丙醇漂洗数秒。室温下油红o染色10～15 min，蒸馏水终止染色，细胞内的中性脂肪可被染成桔红色或红色。显微镜下观察各组细胞内脂滴形成情况。
1.2.6 alt、ast、γgt的测定 细胞种植于6孔培养板内,每孔为1 个样本,每组设3个样本,培养72 h 后分别收集上清液。测定alt、ast、γgt。
1.2.7 染色分析 imagepro plus6.0 图像分析软件分析油红o染色图片，每组随机选取3个具有代表性的高倍视野， 计算 脂滴表达的红色iod(积分光密度)值，并进行比较。
1.2.8 数据处理 统计分析用spss13. 0 软件，数据以x±s表示,计量资料组间比较用t检验,p<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 dmso、复方蛋氨酸胆碱对hepg2、l02细胞增殖的影响
dmso 体积分数≤0. 4%时对作用了48 h的hepg2、l02细胞增殖无明显影响(表1)，可作为溶剂使用。复方蛋氨酸胆碱200、300、400 μg·ml-1组作用于hepg2、l02 48 h后对细胞的生长无明显影响(表2)。表1 不同浓度的dmso对hepg2、l02细胞生长的影响
2.2 油酸作用浓度的确定
hepg2细胞组，油酸刺激24 h后，20、40 μg·ml-1胞浆内有少量被染成桔红色或红色的颗粒状脂滴，分布在靠近细胞膜的区域，使整个细胞的形态表2 不同浓度的复方蛋氨酸胆碱对hepg2、l02细胞生长的影响
呈现出“印戒”状，随着浓度的递增，细胞内的红色脂滴数量逐渐增多。80 μg·ml-1细胞内的红色脂滴较明显，120 μg·ml-1存在活细胞数减少明显，且在光镜下观察发现细胞边缘不清晰，细胞内颗粒较多，细胞大量浮起和坏死。48 h后各组细胞内的红色脂滴开始减少。故选择80 μg·ml-1，24～48 h作为hepg2脂肪肝体外模型的刺激浓度和观察时间。
l02细胞空白组可见少量红色的脂滴。油酸刺激24 h后，20、40 μg·ml-1细胞内可见少量染成红色的脂滴，随着浓度的递增，细胞内的红色脂滴数量逐渐增多。60 μg·ml-1细胞内的红色脂滴较明显，100 μg·ml-1存在活细胞数减少明显，且在光镜下观察发现细胞边缘不清晰，细胞内颗粒较多，细胞大量浮起和坏死。72 h后各组细胞内的红色脂滴开始减少。故选择60 μg·ml-1，24～72 h作为l02脂肪肝体外模型的刺激浓度和观察时间。
2.3 复方蛋氨酸胆碱对脂肪肝细胞模型的影响
2.3.1 复方蛋氨酸胆碱对hepg2细胞脂肪肝细胞模型的影响
以80 μg·ml-1油酸作为hepg2脂肪肝体外模型的刺激浓度，24、48 h，见hepg2细胞脂肪肝变性，见图1。复方蛋氨酸胆碱200、300、400 μg·ml-1，24、48 h，均未见细胞内的脂滴明显减少。
2.3.2 复方蛋氨酸胆碱对l02细胞脂肪肝细胞模型的影响
以60 μg·ml-1油酸作为l02脂肪肝体外模型的刺激浓度，24 h，复方蛋氨酸胆碱200、300、400 μg·ml-1均未见明显的脂滴减少， 48 h复方蛋氨酸胆碱各组脂滴有不同程度减少，见图2。
2.4 l02细胞脂滴表达的油红o染色图片
采用imagepro plus 6.0 图像分析软件，分析油酸刺激48 h对l02细胞内脂滴的影响。每组随机选取3个具有代表性的高倍视野， 计算 脂滴表达的红色iod值，各给药组与模型组比较，脂滴减少，差异有极显著性(p<0.01),见图3。
2.5 细胞培养液中丙氨酸氨基转移酶(alt)、ast天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、γ谷氨酰转肽酶(γgt) 的活性变化
通过检测细胞上清液中的alt、ast、γgt，可以反映肝细胞的损伤程度，复方蛋氨酸胆碱随剂量加大对肝细胞损伤加大，但都较模型组小，中、低剂量组alt，低剂量组ast、γgt与模型组比较差异有统计学意义(p<0.01)。见图4。
3 讨论
nafld 是一种无过量饮酒史、肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。近年来，我国由高脂血症、高血压、肥胖、糖尿病等引起的非酒精性脂肪肝的发病率呈上升趋势。积极研究开发 治疗 脂肪肝的高效、价廉、方便、安全的药物意义重大。建立脂肪肝细胞模型能有效地缩短筛选治疗药物的进程，有助于筛选大量的药物。日本学者yasuyuki o等应用0.10 mmol/l，1.0 mmol/l浓度的油酸作用于hepg2细胞24 h后，成功造成肝细胞脂肪变性模型[5]。ariel ef[6]还用油酸和亚油酸的混合物也造成原代鼠肝细胞和hepg2肝细胞内的脂质沉积。yasuyuki fujimoto等[7]研究表明，在链长为c12-c18的长链脂肪酸能使人源性的肝细胞株形成明显的脂滴。肝细胞摄取长链脂肪酸并将其酯化成中性脂滴后储存于细胞内。因此，增加细胞外的长链脂肪酸能增强细胞内脂肪的生成，从而引起肝细胞脂肪变。
因此，本研究采用油酸刺激hepg2和l02细胞油红o染色镜下观察脂滴形成的时量和时效关系。发现一定浓度油酸刺激hepg2和l02细胞24 h后，肝细胞内积聚了大量的中性脂滴,但同时发现48 h后hepg2内脂滴开始减退，l02细胞72 h后脂滴开始减退，表明采用油酸刺激hepg2和l02细胞能成功地在体外复制脂肪肝模型，是一个比较简便的方法。
实验观察药物对hepg2和l02脂肪肝体外模型的影响，选用复方蛋氨酸胆碱(东宝肝泰)作为阳性药。复方蛋氨酸胆碱是以蛋氨酸、重酒石酸胆碱、叶酸、b族维生素等药物配制而成的复方制剂，胆碱是卵磷脂的组成成分，可促进磷脂的合成，加速肝内脂肪转运，它和体内甲基转换作用和脂代谢密切相关，而蛋氨酸可提供甲基以合成胆碱。重酒石酸胆碱、叶酸、b族维生素是供给甲基的前体物质，是合成胆碱的重要成分，b族维生素和蛋氨酸又有驱脂作用。故本药能降血脂，改善肝功能和肝病患者的消化系症状，是临床治疗脂肪肝的首选药物。以其作为阳性对照药物有一定的说服力[8]。实验结果的油红o染色图片及图像分析软件分析结果证明了复方蛋氨酸胆碱的作用。通过检测细胞上清液中alt、ast、γgt可以反映肝细胞损伤情况，本实验显示模型组培养上清中的alt、ast、γgt显著升高,与对照组差异明显,表明肝细胞损害较重。发生这些变化的原因可能是:由于ffa 摄入增加,tg合成增多,使线粒体β氧化速度代偿性增加,为脂质过氧化提供了足够的反应基质,产生了大量具有反应活性和细胞毒性的活性氧簇(ros)[9]。ros使细胞内抗氧化物质大量消耗,细胞损害加重。复方蛋氨酸胆碱组与模型组比较差异较小，表明复方蛋氨酸胆碱组对肝细胞损伤较小，是一个较好的抗脂肪肝药。
实验发现，hepg2细胞的脂肪肝模型药物难以使细胞内脂滴减少，可能是因为该模型中，细胞内脂滴消失较快，药物作用的时间太短而无法观察到药效。对于hepg2细胞的脂肪肝模型48 h就可见脂滴减退，这可能与肿瘤细胞代谢较快有关。而对于l02细胞在2次给药后，油酸刺激48 h后给药组脂滴可见减少，可见药物对脂肪的干预作用需要有足够的作用时间，这与临床上降脂药普遍需要长疗程相吻合。本实验通过比较hepg2、l02两种细胞系，给予同样的造模方式和给药方式，可见l02细胞比hepg2细胞更适合作为体外的筛药模型。油酸刺激l02细胞形成脂肪变，药物提前24 h干预，24 h后再给药一次，这种造模和给药方案可作为一种可行的脂肪肝细胞筛药模型使用。
【 参考 文献 】
[1] 曾民德.脂肪肝[j].中华消化杂志，1999，19(2)：120.
[2] farrell g c,larter c z. nonalcoholic fatty liver disease :from steatosis to cirrhosis[j]. hepatology,2006,43(suppl 1):99-112.
[3] 张慧，胡义扬，冯琴，等.祛湿化淤方对游离脂肪酸诱导的hepg2细胞脂肪沉积和tnfα分泌的抑制作用[j].
