【摘要】 摘要:目的 建立检测注射用重组人干扰素α2b半成品中外源性dna残留量的方法。 方法 以重组人干扰素α2b工程菌基因组dna为模板,用地高辛标记探针,以此探针杂交并进行显色反应。 结果 半成品中每人份剂量的外源性dna残留量均小于10 ng。 结论 该方法检测特异性较强,操作较安全简便,可用于重组人干扰素α2 b制备过程中的质量监控及半成品的检定。
【关键词】 地高辛 dna残留量 重组人干扰素α2b
注射用重组人干扰素α2b是利用携带人白细胞干扰素α2 b基因质粒的重组大肠杆菌生产所得，具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖以及提高免疫功能等作用。主要用于 治疗 一些病毒性疾病，如急慢性病毒性肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣等。由于在生产过程中使用了工程菌大肠杆菌,而宿主菌的残留dna是重组药物中特有的潜在致癌性杂质,因此对干扰素α2 b半成品中外源性dna残留量的检测极为重要［1，2］。本文使用地高辛标记探针杂交法检测注射用重组人干扰素α2 b半成品中的外源性dna残留量，操作较安全简便,可用于重组人干扰素α2 b制备过程中的质量监控，从而保证了其安全性,符合相关质控标准［3］。
1 材料与方法
1．1 材料与试剂
重组人干扰素α2b工程菌的宿主菌（北京生研所）和重组人干扰素α2b半成品(深圳海王英特龙生物技术有限公司提供)；地高辛标记和检测试剂盒（roche）；正电荷尼龙膜（millipore）；细菌基因组dna提取试剂盒（dp2001,北京百泰克生物技术有限公司）；蛋白酶k（amresco）；鲱鱼精dna（sigma）；其余试剂均为分析纯。www.11665.COM
1.2 工程菌基因组dna的制备
大肠杆菌的基因组dna通过百泰克细菌基因组dna提取试剂盒制备,并通过1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法测定提取的dna纯度和浓度,并将提取的dna于-20 ℃冻存备用。
1.3 探针的制备
取1 μg基因组dna,加入无菌双蒸水至终体积15 μl,沸水浴10 min 后, 迅速转入冰浴中冷却。取hexanucleotide mixture 2 μl和dntp labeling mixture 2 μl加入变性dna中,并加入klenow enzyme 1 μl混匀，于37℃孵育过夜。加入0. 2 mol/l edta(ph8. 0)缓冲液2 μl、3mol/l醋酸钠溶液2.5 μl和无水乙醇75 μl，置－20 ℃冰箱中2 h以上。15 000 r/min离心10 min，弃去上清，沉淀用te缓冲液复溶即得探针溶液。
1．4 探针标记效率的检测
取diglabeled control dna都稀释成1 ng/μl,分别依次稀释至10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.01 pg/μl,同时取标记好的探针，按上述方法依次稀释，然后分别取各浓度点样10 μl于尼龙膜上,经固定和封闭后, 通过ap缓冲液和nbt/bcip进行显色反应,比较两者显色深浅从而确定标记探针的浓度。
1.5 样品的处理
取2批重组人干扰素α2b半成品,用dna稀释缓冲液将样品稀释至含每100 μl含1/10人份剂量备用。
1．6 外源性dna残留量的检测
将2批半成品、阳性对照（基因组dna）、阴性对照（dna稀释液）和空白（te缓冲液）经蛋白酶k预处理后［4］，沸水浴10 min，立即冰浴冷却，8 000 r/min离心5 s，点膜、固定、68 ℃杂交过夜，之后用ap缓冲液和nbt/bcip进行显色反应，与阳性对照比较，根据显色深浅判定半成品中外源性dna的含量。
1.7 重现性试验
按上述检测方法，对2批重组人干扰素α2 b半成品重复测定3次，比较3次的结果，考察该检测方法的重现性。
2 结果
2．1 工程菌基因组dna
取部分基因组dna电泳,结果见图1。结果表明制备的基因组dna完整性较好,a260/a280比值为1.85,纯度符合要求。
m.dna maker;1.engineering bacteria genome dna
图1 工程菌基因组dna电泳图（略）
figure 1 electrophoresis of engineering bacteria genome dna
2．2 探针标记效率的检测
探针标记效率的检测结果见图2。从图中可见，标记探针0.1 pg稀释点可见显色,表明标记探针达到预期的标记效率,而且效率较高,经比较两者显色深浅,表明标记达到要求的量,确定探针浓度为100 ng/μl,总量为2 000 ng。
图2 探针标记效率检测图（略）
figure 2 detection of probe labeling efficiency
2．3 重组人干扰素α2 b半成品中外源性dna残留量的检测
用标记的探针检测干扰素α2 b半成品中dna的残留量，结果见图3。结果表明，1/10人份剂量的2批半成品中外源性dna残留量均小于1 ng,因此1人份剂量的半成品中dna残留量小于10 ng。
2．4 重现性试验
按上述检测方法，对2批重组人干扰素α2 b半成品重复测定3次，3次的测定结果一致，均为1人份剂量的半成品中dna残留量小于10 ng，则表明该方法的重现性较好。
a1～a3: the content of standard dna were 0.1,1,10 ng/100μl; a4: negative control; a5: blank control; b1～b2: the two batches of semi-finished products
图3 注射用重组人干扰素α2b半成品中外源性dna残留量检测图（略）
figure 3 detection of residual dna in semifinished products of recombinant human interferon α2b for injection
3 讨论
以往dna残留量的检测大都采用同位素法，因此操作人员会受到放射性同位素辐射的危害。地高辛标记探针法则避免了放射性的危害，且探针法操作较简便，也避免了同位素检测时包片曝光等诸多环节导致的实验结果误差［5，6］。在探针法中总dna的提取可用不携带表达基因的细菌，也可用重组的工程菌，提取的总dna中不应被rna或蛋白污染，否则将会影响到紫外定量的准确性，同时也会影响到标记探针的灵敏度和特异性。在杂交过程中，杂交液的ph值对反应的灵敏度影响较大。通过本文的研究发现，地高辛标记探针法测定dna的残留量有着特异性高、操作简便和重现性好的特点，可以用于注射用重组人干扰素α2b生产过程中的质量监控,从而保证其安全性,符合国家制定的相关质量控制标准,也可以推广至其他重组大肠杆菌生物制品中dna残留量的检测。
【 参考 文献 】
［1］ 佘清.第57届who生物制品标准化专家委员会会议简况［j］.
