【摘要】  目的：观察寒湿痹片对mtb诱导的大鼠佐剂性关节炎踝关节组织病理改变的影响。方法：将sd大鼠50只，随机分成正常组、模型组、寒湿痹片高剂量组、寒湿痹片低剂量组、来氟米特组，每组10只。除正常组外，其余各组用热杀死结核分枝杆菌h37ra(mtb)与矿物油混匀，一次性经尾根部皮下注射，诱导sd大鼠实验性类风湿关节炎的发生，观察各组大鼠踝关节滑膜、软骨、关节腔、周围软组织炎症反应等组织病理改变情况，进行综合评分。结果：与模型组比较，寒湿痹片能显著抑制炎症细胞的浸润和滑膜增生，减轻软骨损伤程度(p<0.01)。结论：寒湿痹片对实验性类风湿关节炎的滑膜增生及关节炎症具有显著的抑制作用。

【关键词】  寒湿痹片 佐剂性关节炎 病 理

effects of hanshibi on pathology of ankle tissue in rheumatoid arthritis rats

　　chen yuyao,tong li,wu qifu,et al.tcm college of southern medical university,guangzhou(510515),china

　　abstract objective:to study the effect of hanshibi(a traditional chinese preparation) on pathological changes of ankle tissue in rheumatoid arthritis rat induced by mtb in sd rats.methods:the sd rats were randomly divided into the control group,model group,hanshipi high dose,and hanshipi low dose groups; positive controls were given leflunomide,10 cases in each.the adjuvant-induced rheumatoid arthritis (aa) in rats was established by s.c.immunization with the heat-killed mycobactrrium tuberculosis h37ra(mtb)in mineral oil.the pathological changes in ankle synovial membrane,cartilage,cavity of joint,and inflammatory cell infiltration in surrounding soft tissue were graded.results:hanshibi inhibited inflammatory cell infiltration and synovium hyperplasia and lightened the degree of injury on cartilage in aa rats as compared with the control group(p<0.01).conclusion:hanshibi could significantly inhibit synovium hyperplasia and inflammation of joint on aa rats induced by mtb.

　　key words hanshibi adjuvant-induced arthritis pathology

　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis ra)是一种病因不明的自身免疫性疾病，其主要的病理变化包括关节炎性细胞浸润、滑膜增生、关节软骨及骨组织破坏。www.11665.CoM寒湿痹片是国家六类新药痹病系列药之一，为中华中医药学会风湿病分会协定处方，主要由附子、制川乌、黄芪、桂枝、麻黄、白术、当归、白芍、威灵仙、细辛和甘草组成，主治寒湿痹阻证。临床观察[1]表明，寒湿痹片对改善关节疼痛、冷痛等症状具有较好的疗效。本研究旨在观察寒湿痹片对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,aa)模型踝关节组织病理改变的影响。

　　1 实验材料

　　1.1 动 物

　　sd大鼠60只，雄性，体重160±10g，合格证号:2006-a051，由南方医科大学动物实验中心提供。

　　1.2 药物与试剂

　　寒湿痹片(批号：20071101，由辽宁好护士药业集团提供);来氟米特(苏州长征-欣凯制药有限公司，批号：h20000550); heat-killed mycobacterium tuberculosis h37ra (mtb)，购自美国 difco laboratories (detroit,mi,usa);矿物油(mineral oil)，购自美国sigma公司，进口分装。其它化学试剂购自广东化学试剂公司。

　　1.3 仪 器

　　olympus bh-2荧光显微镜，日本olympus公司生产;leica rm2135型切片机，德国leica公司生产。

　　2 实验方法

　　2.1 mtb诱导大鼠类风湿关节炎模型的制备[2,3]

　　准确称取mtb，放入高压消毒的研钵中，在无菌条件下，充分研磨，使mtb的颜色由灰色变为白色，然后加入少量矿物油，使mtb与矿物油充分混合，再研磨，最后加入矿物油使浓度到达5mg/ml，将该混悬液吸入特制玻璃注射器中，连接二只注射器与三通管上，使mtb-矿物油混悬液充分混合均匀，备用。将动物固定在大鼠固定器上，剃掉尾根部的毛发，以75%酒精消毒，然后在尾根部经皮下注射mtb诱导剂1mg/只，注射后，立即用消毒棉球压住注射部位，防止液体渗出。

　　2.2 实验分组及给药

　　sd大鼠60只，雄性，体重140～160g，适应性饲养1周后，剔除不合格动物，余下大鼠50只，随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、寒湿痹片高剂量组和寒湿痹片低剂量组共5组，每组10只。空白对照组和模型组每天灌胃生理盐水2ml/只;阳性对照组灌胃来氟米特(leflunomide，lef)5mg/kg;寒湿痹片高剂量及低剂量组分别灌胃寒湿痹片混悬液3.2g/kg体重及1.6g/kg体重。实验周期为28天。

　　2.3 病理组织学检查方法[4]

　　实验结束后处死动物，取其踝关节置-80℃冰箱内冷冻，10小时后取出，纵向沿中间切开成两半，放入脫钙剂[脫钙剂成分：浓盐酸∶福尔马林∶蒸馏水 (2∶10∶88)]中脱钙后常规石蜡包埋，切片厚5μm，经he染色后，观察关节滑膜被覆上皮有无细胞变性、增生，间质有无炎性细胞浸润及肉芽组织形成;关节腔有无减小或闭塞，关节软骨有无破坏或纤维化;关节周围皮下组织有无炎细胞浸润或纤维化，根据关节各部位病变轻重程度，依次定量为1分(轻度或少量)、2分(中度或多量)、3分(重度或大量)、4分(极重度)，无病变组织定为0分。关节周围皮下组织病变以半量计算。累加所有分数，得出总分，计算出各组每只动物的均分，分值越高提示损伤越严重，反之说明经药物治疗后损伤减轻，治疗有效。

　　2.4 统计学方法

　　所有数据均用±s表示，采用spss13.0统计软件one-way anova lsd 法进行统计处理。

　　3 实验结果

　　3.1 各组大鼠踝关节滑膜组织病理改变

　　正常组所有大鼠关节表面被覆薄层透明软骨，细胞排列整齐，关节面光滑，软骨内无血管和神经。关节囊由结缔组织构成，囊腔光滑，表面覆有1～4层滑膜细胞。软骨下为骨组织，由松质骨组成。关节周围由肌腱横纹肌结缔组织组成，表面被有复层鳞状上皮，未见明显病理变化。见图1。

　　模型组9只大鼠关节滑膜细胞有轻～中度变性与轻～极重度增生，呈短绒毛状或指突状伸入关节腔内。滑膜有少量到多量炎细胞浸润，并有少量到多量肉芽组织形成。关节腔内未见炎性渗出物，但9只大鼠关节软骨有轻度到极重度破坏、表面有纤维结缔组织增生，1只大鼠纤维结缔组织增生明显，导致关节腔消失。周围软组织有中重度炎细胞浸润，炎细胞以类上皮细胞为主，并形成结核结节样病变，外周有淋巴细胞浸润。4只大鼠尚有中性粒细胞呈灶性集聚，形成局部小脓肿。见图2。1只动物未见明显的病理变化。

　　寒湿痹片高剂量组7只大鼠关节滑膜细胞轻～中度变性、增生。轻度的(4只)表现为滑膜细胞层次增多，中度(2只)或重度(1只)增生时呈绒毛状或指突状伸入关节腔内。此外，3只大鼠滑膜有少量炎细胞浸润，其中1只大鼠有少量肉芽组织形成。关节腔内未见炎性渗出物，但3只大鼠关节软骨有轻度破坏，4只大鼠有中度～极重度破坏，表面有纤维结缔组织增生。周围软组织炎症反应轻度3只，中度3只，重度1只，炎细胞浸润以类上皮细胞为主，并形成结核结节样病变，外周有淋巴细胞浸润。3只大鼠未见明显病理变化。见图3。

　　寒湿痹片低剂量组9只大鼠关节滑膜细胞轻～中度变性、增生。轻度的(5只)表现为滑膜细胞层次增多，中度(2只)或重度(2只)增生时呈绒毛状或指突状伸入关节腔内。此外，4只大鼠滑膜有少量炎细胞浸润，其中1只大鼠有少量肉芽组织形成。关节腔内未见炎性渗出物，但4只大鼠关节软骨有轻度破坏，5只大鼠有中度到极重度破坏，表面有纤维结缔组织增生。周围软组织炎症反应轻度5只，中度2只，重度2只，炎细胞浸润以类上皮细胞为主，并形成结核结节样病变，外周有淋巴细胞浸润。1只尚有中性粒细胞呈灶性集聚，形成局部小脓肿。1只动物未见明显病理变化。见图4。

　　来氟米特组9只大鼠关节滑膜细胞轻度到中度变性、增生。轻度的(3只)表现为滑膜细胞层次增多，中度(4只)或重度(2只)增生时呈绒毛状或指突状伸入关节腔内。此外，6只大鼠滑膜有少量炎细胞浸润，其中1只大鼠有少量肉芽组织形成。关节腔内未见炎性渗出物，但3只大鼠关节软骨有轻度破坏，6只大鼠有中度到极重度破坏，表面有纤维结缔组织增生。周围软组织炎症反应轻度4只，中度3只，重度2只，炎细胞浸润以类上皮细胞为主，并形成结核结节样病变，外周有淋巴细胞浸润。1只动物未见明显的病理变化。见图5。

　　3.2 各组大鼠踝关节组织病理改变程度评分比较

　　与模型组比较，寒湿痹片高剂量组大鼠踝关节组织病理改变明显减轻(p<0.01);低剂量组、来氟米特组也有不同程度的改善;寒湿痹片高剂量组优于来氟米特组(p<0.05)。见表1。表1 各组大鼠踝关节病变程度评分比较与模型组比较，**p<0.01;与来氟米特组比较，△p<0.05

　　4 讨 论

　　ra病因尚不清楚。本实验采用的ra模型大鼠是公认的反映ra发病机制的动物实验模型，其组织病理学改变包括滑膜的细胞增生和以组织细胞和淋巴细胞浸润为主的滑膜炎并有血管翳形成;软骨和骨的局灶性破坏可致关节纤维性强直，与人类ra具有部分相似性[5]。

　　ra属中医“痹证”范畴。其发病系营卫不固，外感风、寒、湿邪，导致气血不畅，经络阻滞，痰瘀凝结为痹。病情反复发作，病程迁延，寒湿之邪郁久化热伤阴，故病机寒热错杂。寒湿痹片重用附子、川乌温经通阳、散寒祛湿;当归、桂枝、麻黄、威灵仙、芍药温经和营止痛，通经络，引药直达病所;黄芪、白术益气健脾渗湿;甘草调和诸药。诸药配合，能祛寒除湿，温通经络。

　　本实验结果显示，与正常组比较，模型组病变最重，多数大鼠踝关节有程度不等的病理改变，主要表现为踝关节滑膜细胞增生、炎性细胞浸润;关节腔内关节软骨有中度到极重度破坏，表面有纤维结缔组织增生，甚至导致关节腔闭塞;关节周围软组织见明显的炎症反应。寒湿痹片高剂量组大鼠踝关节组织病理改变则明显减轻，表现为大鼠踝关节滑膜细胞增生、炎性细胞浸润均较轻，关节软骨破坏较轻、纤维化不严重，未见关节面粘连，周围软组织炎症反应多不严重。寒湿痹片低剂量组和来氟米特组也有一定的作用。提示寒湿痹片能有效抑制关节滑膜细胞增生、炎性细胞浸润，从而减轻关节滑膜炎症反应，阻止关节内和关节周围组织破坏。

【参考文献】
  　　[1]王承德，姜泉，冯兴华，等.寒湿痹片治疗风湿病寒湿痹阻证临床研究[j].中国中医急症，2008，17(2)：175.

　　[2] perrson cm.development of arthritis,periarthritis and periostitis in arts given adjuvants[j].proc soc exp biol med，1956,91:95-101.

　　[3] cai x,wong yf,zhou h,et al.manipulation of the induction of adjuvant arthritis in sprague-dawley rats[j].inflamm.res,2006,55(9):368-377.

　　[4] 何晓瑾，夏卫军，金实.痛痹方对佐剂性关节炎大鼠踝关节组织病理改变的影响[j].中国中医药信息杂志,2007,14(4)：44-46.