作者：钱东翔 张洪钿 罗鹏 郭炜  王智坚 李珺 秦玲莎

【摘要】目的  通过免疫组化染色的方法研究成年sd大鼠脊髓中nt-3及其受体trkc的原位分布和亚细胞定位，探讨内源性nt-3的作用机制。方法  以健康成年sd大鼠为实验动物，取脊髓各节段的运动神经元组织标本作免疫组化染色，以了解nt-3及trkc的原位分布和亚细胞定位。结果  观察到不同强度的nt-3及trkc免疫阳性产物广泛分布于大鼠脊髓的运动神经元、中间神经元和胶质细胞。nt-3定位于胞浆和胞核，胞核染色明显，强于胞浆和神经纤维。trkc主要定位于阳性细胞的胞浆内，极少出现在树突或神经末梢上。结论  nt-3及trkc在成年sd大鼠脊髓的运动神经元有差异性表达，提示二者均参与了大鼠脊髓神经细胞的生理功能，但在不同区域又发挥着不同的作用。
【关键字】神经营养因子  nt-3  trkc  免疫组织化学  分布
        神经营养因子（neurotrophic factors ,ntfs）是能促进神经元存活，诱导其分化，并对神经系统的发育及功能的维持起作用的一类多肽[1]。wWW.11665.CoM至今，已发现的ntfs不下20余种。nt-3是迄今为止发现的，在动物发育过程中表达最强的神经营养因子[2]。ntfs的成员不仅可促进神经细胞存活，刺激轴突生长，调节突轴可塑性和神经传递，在神经细胞的生长、发育、分化及功能维持中发挥作用，而且可以促进损伤神经元的修复和再生，从而减轻脑或脊髓损伤后继发性损害的程度，因此在神经损伤修复过程中起着重要作用[3-6]。所以，各国神经科学家在这一领域广泛地开展研究。即便如此，在体内，内源性的nt-3在不同种类的神经细胞发挥怎样的生理作用及其作用模式目前尚不清楚。绝大多数是ntfs参与神经组织损伤的相关性研究，例如应用外源性ntfs促进神经功能修复等，而要澄清ntfs在cns不同部位、不同神经元群间的转运模式和作用机制，必须深入了解ntfs蛋白在cns的区域分布和亚细胞定位。本实验拟通过免疫组化染色的方法研究成年sd大鼠脊髓运动神经元中nt-3的原位分布和亚细胞定位，探讨内源性nt-3的作用机制。
        1  材料与方法
        1.1实验动物  实验用sd大鼠，体重200～220克，微生物等级为spf级，均为雌性，饲养温度20～24℃，正常饮食，自由饮水。购自广东省医学实验动物中心，经广东省实验动物监测所检验检疫符合实验动物标准，许可证号为：scxk(粤)2003－0002  粤监证字2008a020。
        1.2实验试剂  兔抗nt-3多克隆抗体（millipore，效价1:1000）、鼠抗trkc单克隆抗体（millipore，效价1:3000）、sp三步法试剂合、浓缩型dab 试剂合、荧光二抗试剂、免疫组化常规试剂等。
        1.3免疫组化取材  将待取材大鼠过量麻醉，用4%多聚甲醛心内灌注固定，取双侧颈髓、胸髓、腰髓三个部位的各两小节段脊髓组织。后固定后作梯度浓度蔗糖脱水，再作连续切片制作标本玻片，用nt-3及trkc抗体行免疫组织化学染色。
        2  结果
        2.1 nt-3在sd大鼠脊髓中的分布及亚细胞定位
        2.1.1脊髓灰质  在脊髓灰质腹角，可见nt-3免疫阳性神经元，以大运动神经元为主，特别是ⅷ、ix板层染色明显（图1）。在灰质背角的ⅰ、ⅱ板层，可见毛刷状的nt-3免疫阳性神经元，但染色较弱。在中央管附近的clarke核（clarke nucleus，cn）可见nt-3强阳性染色的神经元。 
        
        图1   nt-3在正常成年sd大鼠脊髓腹角阳性运动神经元的免疫组化染色×200
        2.1.2脊髓白质  在整个白质区的横断面上，可见弱阳性的nt-3免疫阳性纤维和细胞，从形态上判断，细胞形似星状胶质细胞和小胶质细胞。
        2.1.3亚细胞定位  在胞浆和胞核均可观察到nt-3免疫阳性产物，胞核染色非常明显，比胞浆染色更强，少量阳性神经纤维着色。
        2.2 trkc在sd大鼠脊髓中的分布及亚细胞定位  在正常的脊髓中，trkc的免疫阳性产物被检测到在运动神经元和中间神经元中均有表达。trkc的亚细胞定位主要是位于阳性细胞的胞浆内，极少出现在树突或神经末梢上（图2）。在白质内被gfap标记的星型胶质细胞也同样可见trkc抗体的阳性表达。 
        
        图2   trkc在正常成年sd大鼠脊髓前角运动神经元的免疫组化染色×300

        3  讨论
        在本研究中，我们观察到nt-3及其受体trkc均在脊髓腹角运动神经元有所表达，说明正常情况下提示二者有协同维持神经元存活的作用。nt-3阳性免疫产物见于脊髓背角ⅱ板层的lissauer’s束，提示nt-3可由脊神经的假单极神经元合成，通过轴突转运，输送到脊髓背角ⅱ板层以维持ⅱ板层内感觉神经元的存活。
        在中央管附近的clarke核（clarke nucleus，cn）可见nt-3强阳性染色的神经元，novikova等[7]发现大鼠颈髓损伤后，虽然clarke核神经元同时表达trkc和trkb受体，但仅有nt-3具有神经保护活性：即鞘内注射nt-3后，clarke核神经元的存活率从60％升高到91%，而联合运用bdnf和nt-3后，nt-3对cn的保护作用则不复存在，表明：外源性的nt-3对clarke核有良好的保护作用，我们的研究在体内更进一步证实了这一结果。
        nt-3和trkc在正常脊髓细胞的亚细胞定位有所不同。nt-3免疫阳性产物主要分布于核内，胞浆和突起的染色相对较浅，以大运动神经元为主，特别是ⅷ、ⅸ板层染色明显。在灰质背角的ⅰ、ⅱ板层，可见毛刷状的nt-3免疫阳性神经元，但染色较弱。在中央管附近的clarke核可见nt-3强阳性染色的神经元。而trkc在运动神经元和中间神经元中均有表达，trkc的亚细胞定位主要是位于阳性细胞的胞浆内，极少出现在树突或神经末梢上。在白质内被gfap标记的星型胶质细胞也同样可见trkc抗体的阳性表达。nt-3的受体有两类，膜受体和核受体，前者位于细胞膜，后者位于细胞核，核受体的存在为nt-3进入核内发挥作用提供了可能。
        顾玲等人[8]的研究表明：trkc的免疫阳性反应物可见于脊髓灰质腹角的运动神经元，而已有研究发现脊髓运动神经元和其靶组织均表达nt-3 mrna[9，10]，结合我们对nt-3蛋白表达的研究，提示腹角运动神经元可自主合成nt-3，但也可通过摄取方式获得nt-3，而且nt-3在脊髓前角运动细胞可能存在自分泌－旁分泌的作用模式。在脊髓背角，浅层阳性细胞少见，但ⅱ板层可见trkc阳性染色明显深于其他层。我们也在背角ⅱ板层发现nt-3阳性膨体，进而提示，ⅱ板层是nt-3的作用位点，trkc可能与这些部位的nt-3发挥作用有关。
参 考 文 献
[1]levi-montalcini r. the nerve growth factor : thirty-five years later. science, 1987, 237: 1154-l164.
[2]maisonpierre pc, belluscio l, friedman b, et al. nt-3, bdnf and ngf in the developing rat nervous system:parallel as well as reciprocal patterns of expression. neuron, 1990,5:501-509.
[3]sharma hs.post-traumatic application of brain-derived neurontrophic factor and glia-derived neurotrophic factor on the rat spinal cord enhances neuroprotection and improves motor function. acta neurochir suppl，2006，96: 329-34.
[4]shumsky js, tobias ca, tumolo m, et al. delayed transplantation of fibroblasts genetically modified to secrete bdnf and nt-3 into a spinal cord injury site is associated with limited recovery of function. exp neurol，2003，184(1): 114-30.
[5] hung ks, tsai sh, lee tc, et al. gene transfer of insulin-like growth factor-i providing neuroprotection after spinal cord injury in rats. j neurosurg spine，2007，6(1):35-46.
[6]yan j, xu l, welsh am, hatfield g, et al. extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. plos med，2007，4(2): 39.
[7]novikova ln, novikov ln, kellerth jo, et al. bdnf abolishes the survival effect of nt-3 in axotomized clarke neurons of adult rats. j comp neurol,2000,428(4):671-680.
[8]顾玲，高玉陪，唐太昆，等.trkc在成年猫脊髓和背根节的分布.昆明医学院学报，2000,21(l):34-36.
[9]ernfors p，wetmore c, olson l, et al. identification of cells in rat brain and peripheral tissues expressing mrna for members of the nerve growth factor family. neuron, 1990,5:511-525.
[10]maisonpierre pc,belluscio l.neurotrophin-3:a neurotrophic factor related to ngf and bdnf.science,1990,23,247(4949 pt 1):1446-1451.