作者：崔飞伦，邱镇，陆洪兵，姚震，林大春
【摘要】 目的： 探讨针对转化生长因子β1（tgfβ1）的小干扰rna（sirna）对大鼠肾间质细胞系（nek293）tgfβ1的表达、细胞周期的抑制及细胞凋亡的诱导作用. 方法 ： 利用rna干扰（rnai）效应设计针对tgfβ1的不同sirna，构建表达载体质粒并转染nek293细胞系. rtpcr和western blot分别检测tgfβ1 mrna及蛋白的表达，细胞生长试验和流式细胞观察转染前后细胞周期及细胞凋亡的变化. 另设一无意义rna载体质粒为阴性对照. 结果： sirna转染效率70%，特异性sirna对tgfβ1 mrna及蛋白的表达具有抑制作用（p>0.05），实验组细胞生长受到抑制、凋亡增加（p>0.05）. 结论： 应用 rnai技术可明显抑制tgfβ1的表达，并高效的抑制nek293的生长、诱导其凋亡.
【关键词】 转化生长因子β1；肾纤维化；rna干扰
0引言
肾纤维化是肾脏多种损伤,如创伤、缺血、肾移植术后慢性排异反应及尿路梗阻等修复的共同转归. 长期以来，肾纤维化被描述为不可逆的静止性瘢痕组织，但近年来的 研究 认为纤维化实际上是一个动态过程，其特征为细胞外基质（ecm）迅速重建和长期的成纤维细胞激活［1］，已知的主要效应细胞为成纤维细胞、肾间质细胞等. 体外研究［2］表明，转化生长因子β1（tgfβ1）是肾间质细胞的主要调控因子. 本研究应用tgfβ1特异性小干扰rna(sirna), 以质粒载体转染大鼠肾间质细胞nek293，观察特异性sirna对tgfβ1的表达，nek293细胞周期及凋亡的 影响 .
1材料和方法
1.1材料hek293细胞（美国clontech公司）；lipofectamine（美国gibco公司）；rtpcr 试剂盒（日本takara 公司）；化学发光试剂，（美国santa cruz公司）；噻唑蓝显色剂（mtt）、碘化丙啶（pi）荧光染料、tritonx100打孔剂（美国sigma公司）；dosper脂质体（美国roche公司）；荧光显微镜（德国opton公司）；tecan sunrise型自动酶联免疫检测仪，coulter epics xl流式细胞仪，ls6500液闪计数仪（美国beckman公司）.
1.2方法
1.2.1特异性sirna设计及载体的构建候选sirna序列通过blast工具搜索,去掉与人类rnas同源性的靶序列，最后选取3个sirna. 根据psilencer3.1h1质粒载体使用说明，将编码sirna的双链互补dna片段插入该载体的bamhi/hindⅲ位点之间以制备发夹cdnas［3］. 表达这3种sirna的重组质粒分别命名为psirna1,2,3. 以bamhi和hindⅲ酶切后电泳观察酶切特异性片段的大小，并对纯化的sirna片段进行dna测序 分析 . 另合成一不针对任何基因的无意义片段作为对照.
1.2.2细胞培养及转染hek293细胞以含100 ml/l灭活小牛血清的rpmi1640培养液，于37℃，50 ml/l co2，饱和湿度培养，2 d换液1次. 取对数生长期细胞进行实验. 按lipofectaminetm2000脂质体转染法，将5 μg psirna(13)和无意义对照质粒转染到hek293细胞中，6 h后更换正常培养基，12 h后荧光显微镜及流式细胞仪观察转染效率.
1.2.3rtpcr检测psirna1,2,3三个实验组及对照组分别收集细胞（细胞总数为1×107个）按trizol试剂操作步骤提取总rna，选用一步法rtpcr试剂盒. 具体参数及条件根据引物的tm值和扩增片断的大小进行调整.
1.2.4western blot检测收集各组细胞并以pbs洗涤及细胞裂解液裂解，提取总蛋白，电泳及转膜后进行常规免疫反应，显影、定影后将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净吸光度值.
1.2.5mtt比色实验1×104 hek293细胞接种于96孔培养板, 37℃，50 ml/l co2，饱和湿度培养1 d. 按实验要求分别在细胞中加入终浓度为200 nmol/l的sirna，中止培养4 h前加入mtt，应用酶标仪进行检测. 检测490 nm波长处的吸光度a值, 计算 细胞增殖抑制率：增殖抑制率(%) = (1-a实验组/a对照组) ×100%.
1.2.6细胞凋亡检测3 ml培养液含5×105细胞培养于6孔板，用预冷的700 mg/l乙醇固定，4℃过夜，pi（50 mg/l）染色，分析亚二倍体峰. 调整细胞密度为5 ×106/ml，取1 ml细胞悬液，1000 r/min 4℃离心10 min，重复2次，将细胞重悬于200 μl结合缓冲液，加入10 μl膜连蛋白ⅴ (annexin v2f itc)和5 μl碘化丙锭(pi) ，避光室温反应15 min，加入300 μl结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞凋亡情况.
1.2.7转染效率的检测试剂盒中提供带有增强型绿色荧光蛋白(egfp)的载体作为阳性对照用以监测转染效率. 按说明书转染, 24 h后收集细胞, pbs洗涤后固定在20 g/l多聚甲醛中,流式细胞仪检测.
统计学处理： 以spss11.0软件进行分析. 组间差异比较采用方差分析及lsdt检验，p<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1sirna转染效率流式细胞 分析 显示，几乎所有的细胞都摄取了gfp的绿色荧光. 由于sirna分子远小于质粒分子，故转染sirna时转染效率应大于70%（图1）.
a: sirna1组; b: sirna2组; c: sirna3组.
图1各实验组sirna表达载体转染×200（略）
2.2tgfβ1 mrna及蛋白的表达特异性sirna处理后24 h tgfβ1 mrna表达水平明显降低，与非特异性sirna组mrna的表达水平相比较有显著差异（表1，图2）. 特异性sirna转染24 h tgfβ1蛋白表达水平明显下调，与非特异性sirna转染组比较差异有统计学意义，tgfβ1 mrna及蛋白表达在实验组间无显著差异（表1，图3）.
表1脂质体介导的sirna表达载体转染24 h后对tgfβ1表达的 影响 （略）
ap<0.05 vs 阴性sirna对照和阳性sirna对照.
a： 非特异性sirna对照； b： 特异性tgfbeta sirna1； c： 特异性tgfbeta sirna2； d： 特异性tgfbeta sirna3； m： dna marker.
图2rtpcr检测tgfβ1 sirna转染后tgfβ1 mrna表达（略）
a： 阴性sirna对照； b： 阳性gapdh sirna对照； c： 特异性tgfbeta sirna1； d： 特异性tgfbeta sirna2； e： 特异性tgfbeta sirna3.
图3western blot检测tgfβ1 sirna转染后tgfβ1蛋白表达（略）
2.3特异性sirna抑制细胞增殖特异性sirna转染hek293细胞24 h后,细胞增殖平均抑制率与非特异性sirna转染细胞组相比细胞增殖抑制明显增强（p<0.05，表2）.
表2特异性sirna转染hek293细胞24 h后对细胞凋亡和增殖的影响（略）
ap<0.05 vs 阴性sirna对照+lipo.
3讨论
tgfβ1的纯化始于上世纪70年代末，是多功能生长因子的原型［4］. 纤维化的肾组织有较强tgfβ1表达，并与纤维化的程度相关［5］，来自大鼠及人的成纤维细胞在经过tgfβ1处理后都显示出ⅰ型胶原和纤维蛋白合成增加.
fire等［6］发现rna分子操纵着许多细胞功能，可通过互补序列与dna结合，从而关闭或降解已表达的基因. 通过逆转录病毒表达载体，在人肿瘤细胞特异性抑癌基因kras v12，可以导致非依赖生长和成瘤性的丧失［7］. hiv1 ref mrna依赖sirna的有效降解在hiv1前体蛋白和产生sirna的结构共转染的细胞中获得［8］. 本 研究 根据sirna序列设计原则，候选sirna序列通过blast工具搜索,选取3个针对tgfβ1的sirna表达载体经转染入hek293细胞后，均起到rna干扰的作用，对tgfβ1 mrna和蛋白以及下游信号蛋白的活化水平都能明显抑制，明显下调细胞增殖并诱导细胞凋亡.
针对每个基因需要设计并检测多个sirna序列，由于每一sirna序列在与mrna结合过程中，发挥降解作用的效率不同. 因此，根据rnai设计原理一般设计3个位于不同位置rnai序列，进行载体构建，细胞转染，功能鉴定等. 3个rnai序列均有rna沉默的效果，只是效率不同，在转染入细胞后根据rtpcr或northern杂交检测mrna表达，用western杂交检测相应蛋白表达，才能确定rnai的效果［9］.
由于mrna的二级结构及作用机制尚不完全清楚，如果可能，sirna应根据mrna低二级结构的区域设计［10］. 本研究采用的rnai序列在实验中显示出较高的抑制率，为肾纤维化的 治疗 提供了实验基础.
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