【摘要】 目的： 观察甲氧滴滴涕(mxc)对小鼠卵母细胞体外成熟的 影响 . 方法 ： 实验组小鼠未成熟卵用7.25, 14.5，29 mg/l mxc不同浓度培养液培养；对照组小鼠未成熟卵直接用合成人输卵管培养液培养，两组培养时间均为24 h. 观察各组生发卵泡破裂(gvbd)和第一极体(pb1) 的形成, 出现pb1的卵母细胞视为核成熟. 结果： 培养24 h时，卵母细胞gvbd发生率7.25 mg/l mxc组为80.4%，14.5 mg/l mxc组为78.8%，29 mg/l mxc组为78.4%，与对照组的86%相比较并没有明显改变. 培养过程中不同浓度mxc试验组gvbd发生较同期对照组相比较也没有明显延迟. 但在培养液培养24 h时pb1的排出率7.25 mg/l mxc组为52.8%，14.5 mg/l mxc组为44.4%，29 mg/l mxc组为22%，明显低于对照组的71.2%，差异具有统计学意义(p<0.05). 结论： mxc对体外培养的小鼠卵母细胞gvbd发生没有影响，但能抑制其卵母细胞的核成熟.
【关键词】 甲氧氯； 卵母细胞； 体外 研究 ; 细胞培养技术
【abstract】 aim: to investigate the effect of methoxychlor (mxc) on in vitro maturation of mouse oocytes. methods： the oocytes in experimental groups were cultured in hunan tubal fluid(htf) medium supplemented with 7.25，14.5，29 mg/l mxc and the oocytes in the unexposed control group were cultured in htf medium for 24 h. germinal vesicle breakdown (gvbd) and the first polar body (pb1) extrusion were observed in all groups. results: after 24 h of culture, the incidence of gvbd in experimental group(7.25 mg/l, 14.5 mg/l and 29 mg/l mxc) was 80.4%, 78.8% and 78.4% respectively, which was on obvious varience compared to the unexposed control. the process of gvbd occured without any significant delay. the first polar body extrusion of mouse oocytes after 24 h of incubation in the presence of mxc (7.25 mg/l: 52.8%; 14.5 mg/l:44.4%;29 mg/l:22%) was significantly lower than than in the unexposed comtrol group (71.2%). conclusion: mxc could decrease the rate of normal nuclear maturation of mouse oocytes in vitro but exert little impact on the gvbd was seen.
【keywords】 methoxychlor；oocytes；in vitro; cell culture techniques
0引言
甲氧滴滴涕(methoxychlor, mxc)是一种替代滴滴涕的有机氯杀虫剂，因其杀虫效果明显，生物毒性相对较低，在许多国家得到广泛 应用 . 常飞等 ［1-2］通过大鼠染毒实验发现雌性生殖系统对mxc非常敏感，mxc可导致早期流产、出生呼吸窘迫、生长发育迟缓和青春期性发育异常；可干扰孕小鼠的生殖功能, 导致生殖和胎仔发育毒性［3］；能改变小鼠的受孕和妊娠的维持［4］等. 而 目前 有关mxc对体外卵母细胞成熟和受精及胚胎发育的影响的报道却很少. 我们采用mxc体外培养小鼠未成熟卵母细胞，观察mxc对体外成熟时生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，gvbd)和第一极体(the first polar body, pb1)形成的影响，为进一步研究mxc对小鼠卵母细胞发育能力的影响提供依据.
1材料和方法
1.1材料
未成熟卵母细胞取自8~12周龄雌性昆明白小鼠，体质量20~25 g (由第四军医大学实验动物中心提供)；mxc(美国sigma公司)； 孕马血清促性腺激素(pmsg，杭州第二激素制品厂)；合成人输卵管培养液(htf，第四军医大学西京 医院 妇产科实验室提供)；二甲基亚砜(dmso，美国amresco公司).
1.2方法
1.2.1卵母细胞培养液的配制将mxc完全溶解于dmso，-70℃保存备用. 临用前用htf将其分别稀释成7.25，14.5，29 mg/l mxc培养液, 配好后预平衡2 h.
1.2.2卵母细胞的获取在小鼠动情前期注射pmsg 510 iu，44~47 h后脱颈椎处死，取其卵巢置于输卵管液中，在解剖显微镜下用1 ml注射器针头刺破半透明状的卵泡，轻轻挤压使卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complex, coc)溢出，并选择外围至少包绕两层卵丘细胞的coc分为实验组和对照组. 卵母细胞在倒置显微镜下观察，以见到生殖泡者即为未成熟（germinal vesicle, gv期）卵母细胞.
1.2.3体外成熟培养所得coc用预平衡过的htf培养液洗涤3次后移入培养液微滴中，实验组分别用含7.25，14.5，29 mg/l mxc的htf培养液，对照组直接用htf培养液培养于50 ml/l co2 37℃培养箱中培养，总培养时间为24 h. 培养过程中在倒置显微镜下每隔1~2 h观察gvbd的发生率，培养24 h时观察pb1的形成情况. 若不能清楚观察到coc，可以采用巴氏吸管轻轻吹打脱去外层颗粒细胞. gvbd的发生表示减数分裂恢复，pb1的形成表示卵母细胞的核成熟.
统计学处理：采用spss 11.0软件进行χ2检验，p<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1体外培养的小鼠卵母细胞镜下形态变化倒置显微镜观察结果可见，gv期卵母细胞中有一个膨大的细胞核，核膜清晰，可见核仁；细胞质质地均匀；细胞膜与透明带紧贴，透明带厚薄均匀(图1a). 发生gvbd的卵母细胞可见核膜溶解、胞质质地均匀，细胞膜与透明带紧贴，透明带厚薄均匀(图1b). 出现pb1时可见细胞质质地均匀，除次级卵母细胞、pb1和透明带之间有空隙外，其余部分细胞膜与透明带紧贴，透明带厚薄均匀(图1c).
2.2mxc对体外培养的小鼠卵母细胞gvbd发生率的 影响 培养24 h时，gvbd的发生率对照组为86.0%，7.25，14.5，29 mg/l mxc各浓度组分别为80.4%，78.8%和78.4%，与对照组相比较差异均无统计学意义（p>0.05). 培养过程中实验组gvbd较对照组gvbd发生率也没有明显降低. 提示所选择的mxc培养液的浓度并没有阻止coc发生gvbd.
2.3mxc对体外培养的小鼠卵母细胞成熟率的影响培养24 h时, 对照组小鼠卵母细胞pb1形成率为71.2%，而7.25，14.5，29 mg/l mxc各浓度组小鼠卵母细胞pb1形成率分别为52.8%，44.4%和22%，对照组与各实验组间差异均有统计学意义(p<0.05)，比较各实验组之间差异也有统计学意义(p<0.05). 提示mxc在体外实验中降低了正常卵母细胞的核成熟率，且随着mxc浓度的升高核成熟率逐渐下降.
3讨论
有机氯农药作为持久性有机污染物已经引起越来越多的关注, 其中mxc对动物和人类生殖、发育方面的影响是当前关注的焦点. 本实验结果显示即使当mxc浓度达到29.0 mg/l时也不能抑制体外培养的小鼠卵母细胞gvbd的发生，这与alm 等［3］发现mxc以剂量依赖的方式影响了牛卵母细胞gvbd的发生这一结果是相矛盾的. 这可能是由于一方面物种不同，卵母细胞对杀虫剂的敏感性路径不同；另一方面哺乳动物细胞内camp水平的降低与gvbd的发生是相关的［4］，也就是说mxc影响了导致牛卵母细胞gvbd发生的信号转导途径包括它可能降低了牛卵母细胞内camp 水平，但对小鼠卵母细胞gvbd的发生影响不明显.
我们的实验结果提示mxc三个剂量组均可有效抑制体外培养的小鼠未成熟卵母细胞的成熟，并且随着杀虫剂浓度的增加，卵母细胞成熟率逐渐降低. 成熟的关键步骤就是减数分裂纺锤体的形成，因此mxc降低小鼠卵母细胞成熟率的原因可能是由于mxc能直接改变卵母细胞有丝分裂纺锤体微管的聚合，致纺锤体异常或不能形成，细胞分裂无法正常进行，pb1不能形成. 另外mxc也可能作用于有丝分裂促进因子（mitosis promoting factor, mpf），而mpf可以调节微管动力［5］和与纺锤体相关的蛋白活性［6］ .
mxc所具有的难降解性、生物蓄积性和沿食物链在生物体内富集的作用导致它所造成的环境污染遍及全球生态系统，因此， 研究 mxc对卵母细胞的成熟和受精能力的作用及其所致生殖发育损伤的分子生物学机制，可以为优生优育以及临床上一些不明原因的流产、不育的病因研究提供 理论 和实验依据.
【 参考 文献 】
［1］常飞，陈必良，马向东，等.甲氧滴滴涕对雌性大鼠血清雌激素水平及卵巢抗氧化系统功能的影响［j］.第四军医大学学报, 2007, 28(6):521-523.
［2］王晓蓉，陈必良, 马向东, 等.甲氧滴滴涕对孕鼠生殖及其胎鼠发育的影响［j］.第四军医大学学报, 2007, 28(7):634-636.
［3］alm h，torner h，tiemann u，et al. influence of organochlorine pesticides on maturation and postfertilization development of bovine oocytes in vitro［j］. reprod toxicol, 1998, 12:559-563.
［4］schultz rm，montgomery rr，belanoff jr. regulation of mouse oocyte meiotic maturation: implication of a decrease in oocyte camp and protein dephosphorylation in commitment to resume meiosis［j］. dev biol, 1983, 97: 264-273.
［5］andersen ss， karsenti e. xmap310: a xenopus rescuepromoting factor localized to the mitotic spindle［j］. cell biol, 1997, 139:975-983.
［6］verde f，dogterom m，stelzer e，et al. control of microtubule dynamics and length by cyclin aand cyclin bdependent kinases in xenopus egg extracts［ j］. cell biol, 1992, 118:1097-1108.
