作者：刘良，彭江龙，周鹰，崔玉宝
【摘要】 目的： 构建屋尘螨cdna表达文库. 方法 ： 用rnaiso reagent试剂盒提取屋尘螨total rna，用poly at tract mrna分离试剂盒提取mrna，用clontech公司smarttm pcr cdna library kit反转录合成第1链cdna，用ldpcr合成第2链cdna并扩增，pcr产物与maxplax tm试剂盒体外连接包装，建成未扩增的cdna文库， 计算 其滴度和重组效率后进行文库扩增并测定扩增文库的滴度. 结果： cdna文库未扩增时滴度为9.148×106，重组效率达93.88%以上，文库扩增后滴度为7.628×109，插入片段平均1.63 kb. 结论： 成功地构建了高质量的屋尘螨cdna表达文库.
【关键词】 欧洲屋尘螨，基因文库
0引言
随着 现代 分子生物学技术的 发展 ， 应用 基因工程变应原诊断和 治疗 变态反应性疾病已成为当代变态反应学 研究 的主流. 研究表明，基因工程技术通过减少重组变应原ige结合的抗原表位，能有效地降低ige介导的过敏反应，同时通过保留变应原t细胞识别所必须的结构域，因而具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，可以提高脱敏治疗的效果［1-2］.
制备基因工程变应原的前提是获取目的基因. 从 理论 上讲，研究者可从一个合格的基因文库中调取任何目的基因，是发现并获取特异性基因克隆应用于重组变应原研究的有效方法之一. 本研究采用clontech公司smart方法构建屋尘螨cdna表达文库，为系统地研究屋尘螨的基因结构和功能、进一步制备尘螨基因工程变应原奠定基础.
1材料和方法
1.1材料smarttm pcr cdna library kit为美国clontech 公司产品，rnaiso reagent， transcript rna clean up kit均购自日本takara公司，poly at tract mrna分离试剂盒由美国promega公司生产. oligodt纤维素、mmlv反转录酶和maxplaxtmlambda packaging extract购自德国eicentre technologies公司，其余试剂为国产 分析 纯. tp3000 pcr仪（takara），mupid电泳仪(advancebio co., ltd)，imagemaster vds电泳成像装置（pharmacia biotech），abi prismtm 377xl dna sequencer dna测序仪（perkin elmer）.
1.2方法
1.2.1cdna文库的构建解剖镜下挑取屋尘螨约200只，匀浆后用takara rnaiso reagent试剂盒提取total rna，用poly at tract mrna分离试剂盒提取mrna，操作按说明书进行. 参照试剂盒说明书，cdna文库的构建以mrna为模板，smart ⅲ oligonucleotid (dt)为引物，在mmlv反转录酶作用下合成cdna第1链；加入dntps，5 pcr primer，3 pcr primer和advantage ⅱ聚合酶，置基因扩增仪上用长距离pcr(ldpcr)合成得双链dna，取pcr产物5 μl用琼脂糖凝胶电泳检测，以鉴定双链dna分布范围. 经蛋白酶k灭活、sfiⅰ酶切、过柱 (chro2maspin 400) 分级分离后，连续收集12个单滴组分，每组分取2 μl进行琼脂糖凝胶电泳，收集前4个含有cdna的组分，用乙醇沉淀回收. 按照cdna∶vector = 1∶2/1∶1/2∶1 三种方式进行连接，用maxplaxtm试剂盒对连接产物进行体外包装，至此建屋尘螨cdna未扩增文库.
1.2.2未扩增文库滴度测定取3种连接方式稀释度为1∶5，1∶10和1∶20的包装产物各1 μl，分别与过夜液体培养物200 μl混合，并加入融化的lb/mgso4 top agar 3 ml，快速倒在37℃预热的90 mm lb/mgso4平板，快速旋转平板，使top agar水平分布，室温冷却10 min后置37℃倒置培养6~18 h. 统计噬菌斑，计算滴度pfu/ml=噬菌斑数×稀释因子×103/铺板体积(μl). 利用iptg和xgal诱导上述未扩增文库计数蓝、白斑，重组效率=白斑数/(白斑数+蓝斑数).
1.2.3扩增文库滴度计算在10 ml试管中加入过夜培养的xl1blue菌液500 μl和足够的噬菌体液(未扩增文库)，在37℃水浴15 min后，每管加入融化的lb/mgso4 top agar 9 ml，快速混匀铺板，室温冷却后置37℃倒置培养至噬菌斑长满，每块平板加入1×λ稀释液12 ml，4℃过夜，以得到已扩增文库的裂解液；将平板在脱色摇台上室温50 r/min 1 h，用灭菌烧杯收集平板中的噬菌体裂解液，充分混匀后分装于50 ml灭菌离心管，每管加入氯仿10 ml，盖紧，振荡混匀2 min，7000 r/min离心10 min，收集上清液，4℃保存. 扩增文库滴度计算方法同上，所选用的噬菌体裂解液稀释度为10-4，铺板体积为5 μl/12 mm.
1.2.4文库的pcr鉴定随机挑取12个单克隆噬菌斑分别加入到装有100 μl 1×λ稀释缓冲液的管中，并加入xl1blue菌的过夜培养物200 μl，制备dna模板. 根据克隆位点两端的序列设计并委托上海生物工程公司合成引物p1(5′ctccgagatctggacgagc3′)和引物p2 (5′taatacgactcactataggg3′). pcr反应体积为50 μl，具体如下：dna模板 6 μl，引物p1和p2各1 μl (10 μmol/l)，10×advantage 2 pcr buffer 5 μl，10 mmol/l dntp mix 2 μl，50×advantage 2 polymerase mix及ddh2o 34.6 μl. 反应条件：95℃预变性1 min，95℃ 50 s，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃维持10 min. pcr产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定.
取灭菌的1.5 ml eppendorf管，每管加文库裂解液1 ml及dmso 70 μl，混匀，并做好标记、封口，-80℃保存文库.
2结果
2.1cdna文库的构建按takara公司rnaiso reagent 说明书操作获得屋尘螨总rna 30 μl，紫外分光光度计测定核酸含量0.62 g/l，a260/a280=1.87，12 g/l琼脂糖凝胶电泳结果显示18 s和28 s两条带，未见降解(图1)，提示获得的总rna纯度高. 用poly at tract mrna分离试剂盒提取mrna后，以mrna为模板，smart ⅲ oligonucleotid (dt)为引物，在mmlv反转录酶作用下合成cdna第1链，电泳显示第1链cdna大部分集中在0.5~2 kb之间，符合cdna合成的分布 规律 (图2). ldpcr合成得双链dna，取产物5 μl用琼脂糖凝胶电泳检测，合成的双链cdna稍大于第1链，大部分集中在0.5 kb以上（图3）.
1~2: 屋尘螨总rna.
图1屋尘螨总rna电泳图
1: 屋尘螨cdna第1链; m: dna marker dl2000.
图2屋尘螨mrna反转录合成的cdna第1链
2.2未扩增文库滴度计算噬菌斑数结果表明以第2种连接方式所产生的噬菌斑数最多，第3种连接方式次之，第1种连接方式最少，说明第2种连接方式效果最好（表1）. 取3种连接的最小值计算每种连接的滴度，pfu/l=(2.21+16.875+8.36)×0.5×109/(0.5+0.5+0.5) =9.148×109 pfu/l. 重组效率的计算表明，3种连接方式的重组效率(94.77%, 97.66%, 93.88%)均高于80%，满足构建质量文库的需要.
m: dna marker dl2000;1: 屋尘螨cdna第2链.
图3屋尘螨mrna反转录合成的cdna第2链 表13种连接方式在3种稀释度时的噬菌斑数
2.3扩增文库的滴度稀释度为10-5的3个平板内噬菌板最为清晰可数，以此 计算 扩增文库滴度，pfu/l= ［(462/5+637/10+1455/20)/3］×1085×103=7.628×1012（表2）. 表2稀释度为10-5的3个平板计算结果
2.4文库的pcr鉴定根据载体克隆位点两端的序列设计引物进行pcr鉴定，结果显示，所选的12个噬菌体均含有重组cdna，长度在400 bp以上的有2个，500 bp左右的有2个，750 bp以上的有2个，1000 bp以上的有2个，2000 bp及其以上的有4个，平均1.63 kb(图4).
3讨论
尘螨隶属于节肢动物门(arthropoda)、蛛形纲(arachnida)、蜱螨亚纲(acari)，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具较强的
m: dna marker dl2000;1~12: 含重组cdna 的噬菌体pcr产物.
图4屋尘螨cdna文库的pcr鉴定
变应原性，可引起螨性哮喘、异位性皮炎、过敏性鼻炎等ⅰ型变态反应性疾病. 法国n. roche(2000)估计约60%~100%的哮喘患者对尘螨过敏［3］. 国内学者用粉尘螨浸液对哮喘患者进行皮肤挑刺试验，47%~92.11%的成人患者呈阳性反应，51.64%~78.85%患儿对尘螨过敏［4］. 《哮喘全球防治策略》指出，哮喘每年造成的直接或间接损失达100亿美元［5］. 随着 工业 化的 发展 ，人民生活水平的提高，此类疾病的发生不但不下降反而呈上升趋势［6］.
特异性免疫 治疗 被认为是 目前 唯一ⅰ型变态反应性疾病病因治疗 方法 ，即通过逐渐增加、反复皮下注射特异性变应原，提高患者对特异性变应原的免疫耐受力，调节患者细胞免疫功能，增强th1反应,抑制th2反应，并产生高水平的igg抗体阻断变应原结合到ige，以提高患者对特异性变应原的免疫耐受力，达到再次暴露于特异性变应原后不发病或虽发病、但症状明显减轻的目的［1-2,7-9］.
尘螨变应原成份复杂，约有30余种，现已提纯出16类变应原. 目前，临床主要采用尘螨变应原粗提浸液免疫治疗哮喘患者，由于变应原浸液包含成分较复杂，如存在变应原、非过敏性或毒性蛋白及其他成分，所以很难进行变应原标准化，且在治疗中长期使用易导致严重ige介导的过敏反应，如可发生红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、喉头水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应［1-2,7-9］，因此，提高变应原纯度是减少免疫治疗副反应发生的有效途径. 1998年，who发布的关于免疫治疗的指导文件中强调，变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫治疗的变应原应该是纯品而不宜为粗制浸液［7］. 但是，尘螨变应原主要存在于螨的排泄物和皮壳中，采用生物化学方法提纯尘螨变应原，耗时长，过程繁琐，成本较高，且不能从根本上提高变应原的纯度、避免免疫治疗中副反应的发生.
本 研究 提取屋尘螨总rna，反转录合成cdna第1链并用置换法合成双链cdna，用smart方法构建全长cdna表达文库，为进一步研究尘螨变应原基因信息、通过基因工程技术制备重组变应原疫苗用于尘螨变态反应性疾病的诊断和治疗奠定基础.
容量和重组噬菌体中插入的cdna片段长度是评价基因文库的重要指标. 当一个cdna文库的容量为4.6×104~4.6×105时，得到所需克隆的概率为99%，就可以筛选出低丰度的cdna. 本研究所构建的cdna文库未扩增时滴度为9.148×106，文库扩增后滴度为7.628×109，完全满足要求. 为了鉴定重组体中插入的cdna片段的长度，本研究从文库中随机挑选12个噬菌斑进行pcr鉴定，电泳结果显示此11个噬菌斑中均含有重组的cdna，片段长度均在400 bp以上，提示我们所构建的cdna文库质量较好.
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