【摘要】 目的：构建细胞因子受体抗人afp嵌合抗体基因真核表达载体。方法：用rtpcr方法从人胚肝组织中扩增epor胞外区基因及gp130跨膜区基因，并用限制性酶切连接方法拼接。用pcr方法从抗人afp单链抗体表达载体中扩增vl、vh基因，分别与人kappa轻链和人gammal重链恒定区基因重组，获得人鼠嵌合轻链和重链，再将eporgp130与嵌合重链连接，最后将嵌合轻链和heporgp130分别连接到质粒pvitro上，构建pvitroegig载体。结果：获得epor胞外区基因750bp，gp130跨膜区基因900bp。重组真核表达载体经限制性酶切鉴定示epor、gp130基因、嵌合重链基因和嵌合轻链基因正确连接到载体pvitro。结论：成功构建细胞因子受体抗人afp嵌合抗体基因表达载体。
【关键词】 epor；gp130；嵌合抗体；克隆
单克隆抗体技术自1975年问世以来，在生命科学研究及临床疾病检验、治疗等方面的应用日益广泛，然而单克隆抗体多来源于小鼠，使其在体内的应用受到一定限制，因此需对单克隆抗体进行人源化改造。欧美正式批准上市，以及正在临床试用的治疗性单抗中以人源化鼠单抗数量为多。在抗体的制备过程中，抗体的表达载体系统多采用二氢叶酸还原酶（dhfr）基因作为可扩增选择标志基因，同时在培养基中加入甲氨蝶呤（mtx）来得到高拷贝量的抗体表达[1]。但是，mtx具有细胞毒性，会抑制细胞生长、引起细胞形态改变[2]。WWW.11665.COm为了避免抗生素筛选药物对细胞的影响，各国学者做了大量研究。日本学者m.kawahara等人在2003年成功构建了抗原介导的遗传修饰细胞扩增体系（antigenmediated genetically modified cell amplification,amega），将抗体的vl、vh与epor d2功能区和gp130跨膜功能区嵌合表达于细胞膜上，在细胞培养基中加入抗原，通过抗原与抗体的结合，有效地激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而大量扩增细胞[3]。本研究借鉴这一细胞扩增体系构建细胞因子受体抗人afp人鼠嵌合抗体基因，探索获得高表达全抗体的新方法。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒大肠杆菌菌株e. coli dh5α由本室保存。pgemteasy载体购自美国promega公司。载体pag4622、pah4604均由海军总医院王琰教授惠赠。质粒pvitro2购自美国invivogen公司。抗人afp单链抗体表达载体pet32/scfv由本室构建。
1.1.2实验标本标本来源于人胚胎肝脏组织，均取自非疾病死亡的引产胎儿，胎龄28周，胚胎的使用已得到医院和产妇的同意。
1.1.3主要试剂trizol reagent购自美国gibco brl公司。one step rna pcr kit（amv）、ex taq、t4 dna ligase及各种限制酶均购自大连takara公司。胶回收纯化试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自美国omega公司。寡核苷酸引物由上海英骏生物技术有限公司合成（表1）。表1 pcr引物的名称和序列
1. 2方法
1. 2. 1 epor胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆和拼接trizol法提取4月孕流产胎儿肝脏总rna，用epf1/epr1引物对扩增epor胞外区基因，用gpf/gpr引物对扩增gp130跨膜区基因，rtpcr反应条件为50 ℃逆转录30 min，94 ℃预变性5 min，然后94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。胶回收纯化rtpcr反应产物epor1和gp130，并分别克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用epf2/epr2引物对从epor1t载体上扩增epor胞外区基因，在其5′加入肠激酶（enterokinase）的碱基序列：gacgacgacgacaag，胶回收纯化pcr反应产物epor2，并克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用hindⅲ和claⅰ双酶切gp130t载体中的gp130跨膜区基因，和相应酶切的epor2t载体连接，获得eeporgp130t载体。
1. 2. 2人鼠嵌合抗体轻链载体的构建用vlf/vlr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vl基因，用clf/clr引物对从含有人kappa轻链恒定区序列的载体pag4622中扩增cl基因[4]，分别克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用bglⅱ和ecorⅰ双酶切vlt载体中的vl基因，和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitrovl载体。用ecorⅰ和xhoⅰ双酶切clt载体中的cl基因和相应酶切的载体pvitro连接，获得pvitrol载体。
1. 2. 3人鼠嵌合抗体重链载体的构建用vhf1/vhr引物对从抗afp单链抗体表达载体pet32/scfv中扩增vh1基因，克隆到pgemt easy载体上，测序鉴定。用ecor v和nheⅰ双酶切vh1t载体中的vh基因，和相应酶切的含有人gamma1重链恒定区序列的载体pah4604连接[4]，获得vhpah4604载体。用vhf2/chr引物对从vhpah4604载体中扩增人鼠嵌合重链基因vhch，克隆到pgemteasy载体上，测序鉴定。
1. 2. 4细胞因子受体抗人afp嵌合抗体表达载体的构建用bamhⅰ和kpnⅰ双酶切vhcht载体中的vhch基因，和相应酶切的eeporgp130t载体连接，获得heporgp130t载体。用bamhⅰ和claⅰ双酶切heporgp130t载体中的heporgp130基因，和相应酶切的pvitrol载体连接，获得pvitroegig载体（见图1）。
2结果
2. 1epor胞外区基因及gp130跨膜区基因的克隆
trizol法从4月孕胎肝组织中提取总rna，琼脂糖凝胶电泳示：28s和18s条带清晰，且28s:18 s＞1。rtpcr扩增epor和gp130，epor胞外区基因750bp，gp130跨膜区基因900bp，与预计大小一致（见图2）。epor和gp130分别克隆到pgemt easy载体，测序结果经blast比对，与genebank中报导一致。
2. 2细胞因子受体抗人afp嵌合抗体表达载体的构建
重组载体pvitroegig经相应酶切后，分别获得epor胞外区，gp130跨膜区，及嵌合轻链和重链，人鼠嵌合轻链基因630bp，嵌合重链基因1929bp，与预计大小一致（见图3）。结果表明，细胞因子受体抗人afp人鼠嵌合抗体真核表达载体构建成功。
3讨论
甲胎蛋白（alphafetoprotein，afp）是原发性肝癌诊断和生物治疗的一种重要肿瘤相关靶抗原，抗afp单抗多用于肝癌的放射免疫显像和导向治疗。但是单抗为鼠源性，应用于人体时可在体内产生人抗小鼠抗体（hama），既影响单抗的治疗效果，又有可能诱发过敏反应；此外，鼠单抗在人体内的半寿期较短，不能有效激活人体的补体依赖的细胞毒（cdc）作用及抗体依赖的细胞毒（adcc）作用。因此，通过用人igg抗体恒定区取代鼠单抗恒定区进行人源化，可消除其大部分异源性，并能保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力。迄今已构建了很多人鼠嵌合抗体，通过大量的实验和应用证明嵌合抗体确实保留了亲本鼠单抗的抗原结合能力并能降低免疫原性[1]。由本室制备的抗人afp单链抗体具有较高的生物活性，竞争elisa实验显示：以单克隆抗体为阳性对照，抗afp单链抗体可抑制53%的单克隆抗体与抗原afp结合[5]。因此可以将其vl/vh链作为新的嵌合受体的识别单位，通过抗原afp与抗体vl/vh特异性结合，诱发eporgp130融合蛋白的聚合,从而激发细胞生长信号传导，筛选出能与抗原高亲和性结合的抗体表达细胞[3]。
促红细胞生成素受体（erythropoietin receptor，epor）是ⅰ型细胞因子受体超家族成员。 gp130是白细胞介素6（il6）、白血病抑制因子（lif）、抑瘤素m（osm）、睫状神经营养因子（cntf）、白细胞介素11（il11）和心肌营养素1（ct1）所共用的受体和信号传导子[6]。虽然epor与gp130在结构和功能上不尽相同，但是二者之间有很多相似之处。epor与gp130均可结合并激活酪氨酸激酶（janus kinases，jaks），激活的jaks可活化信号转导与转录活化子（signal transducer and activators of transcriptions，stats），使其酪氨酸残基磷酸化，并结合成二聚体转位到胞核内，与特异的靶序列增强子结合调节基因转录[6,7]。也有文献报道gp130与epor分别可直接激活stat3和stat5[8,9]。另外，除了jaksstats信号传导途径之外，gp130与epor还参与激活ras/map激酶途径传导信号[10,11]。m.kawahara等学者首次构建eporgp130异源二聚体，并将其应用于amega体系中，结果发现，与单独转染epor vh/vl或gp130vh/vl的细胞株相比，转染eporgp130vh/vl的细胞株表现出相同的，甚至更好的抗原剂量依赖性生长[12]。
本研究采用多基因共表达载体pvitro，由于其具有两个不同的转录单元，hferh启动子和hferl启动子可分别启动两个转录单元的表达，使l链和heg链在细胞内可无干扰的高水平表达，它与两个单独的载体共转染一个细胞相比要更有效、更方便。我们应用此载体成功构建细胞因子受体抗人afp嵌合抗体真核表达载体pvitroegig，并将用此表达载体转染依赖il3生长的小鼠前b细胞株（ba/f3细胞）以证实抗afp嵌合抗体能与抗原afp高亲和性结合，激发细胞因子胞内生长信号的传导，从而实现抗原介导的细胞大量扩增。
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