【摘要】 目的：研究重组vmipⅱ在体内对食蟹猴免疫系统的影响。方法：食蟹猴随机分为阴性对照组（静脉注射人白蛋白）和实验组（分别连续13周静脉注射50、250和1 250 μg/kg 剂量的重组vmipⅱ），于不同时间采集血液（给药前、给药6周、给药13周和恢复期2周）及各器官、淋巴组织（给药13周和恢复期2周）样品。elisa测定血清中重组vmipⅱ抗体，分离外周血单个核细胞（pbmcs），facs计数cd3+、cd4+以及cd8+细胞并测定淋巴细胞转化率；各器官及淋巴组织样品做病理学检查，并采用末端转移酶介导的缺口标记（tunel）法检测淋巴组织细胞凋亡指数。结果：长期大剂量静脉注射重组vmipⅱ并不引起食蟹猴产生中和抗体；在用药期间动物外周血cd3+t细胞、cd4+以及cd8+t细胞计数显著性增强（p＜0.05），cd4+/ cd8+比值仍属正常，同时体外观察到淋巴细胞转化率增加（p＜0.05）；各器官无病理学改变，淋巴组织出现增生，并且重组vmipⅱ注射组食蟹猴增生的淋巴组织细胞凋亡指数与阴性对照组相比无明显改变；在恢复期以上指标均有所降低。结论：在重组vmipⅱ对食蟹猴免疫原性不明显的情况下，长期大剂量注射重组vmipⅱ具有刺激食蟹猴免疫系统、t淋巴细胞增生和增加t淋巴细胞功能的作用。
【关键词】 重组vmipⅱ 食蟹猴 t淋巴细胞 淋巴细胞增生 凋亡
longterm intravenous administration of recombinant viral inflammatory proteinⅱ intensifies immune system of cynomolgus macaque
sun hanxiao, l qiujun, jiang zhenyou, mo xuemei, zhang guang, chen hong, yang qingling.
center of genome medicine research, jinan university, guangzhou 510632, china
［abstract］ objective:to observe effects of recombined vmipⅱ(rvmipⅱ) on immune system of cynomolgus macaques in vivo.methods:cynomolgus macaques were randomized into one negative group and three test groups subjected to human albumin(1%) or rvmipⅱ(50,250,1 250 μg/kg) continuously for 13w, blood and lymphoid tissue samples were taken at various timepoints of pre and the 6th, 13th and 15th week after animal treatments. serum rvmipⅱ antibodies were tested by elisa, peripheral blood mononeuclear cells(pbmcs) were prepared for total t cells(cd3+), cd4+ and cd8+t cells calculation on facs and determination of lymphocytes transformation ratio, lymphoid tissues biopsy clippings were examined and cells apoptosis indexes were determined.results:longterm intravenous administration of rvmipⅱ didn’t raise strong antibody response in cynomolgus macaques. increasing cd3+, cd4+ and cd8+t cell percentages in pbmcs(p＜0.05) with normal cd4+/cd8+ ratio and lymphocytes transformation ratio(p＜0.05) were observed during the rvmipⅱ administration period. no notable pathological change of various organs was seen and hyperplasia companied by unchanged ai was observed in lymphoid tissues. all of above indexes were decreased during recovery period.conclusion:the antigenicity of rvmipⅱ in cynomolgus macaques is not significant; longterm rvmipⅱ administration could stimulate the immune system by prompting tcells proliferation and functions.
［key words］ recombinant viral inflammatory proteinⅱ；cynomolgus macaques；t lymphocytes；lymphoid tissues hyperplasia；apoptosis
趋化因子和其受体之间的相互作用影响着免疫系统的多个方面，包括白细胞与内皮细胞的相互作用、树突细胞的功能、t细胞的分化和功能、炎症反应和对病毒（hiv1）感染的反应等［1，2］。Www.11665.COm巨噬细胞炎症蛋白ⅱ（viral macrophage inflammatory proteinⅱ，vmipⅱ）与人趋化因子mip1α具有较高的同源性［3］。体外实验研究证明rvmipⅱ是广谱的趋化因子受体抑制剂，可以结合cc、cxc、cx3c多类至少8种人趋化因子受体，并能够竞争性抑制hiv与靶细胞上共受体ccr5、cxcr4、ccr3等的结合，阻止病毒进入靶细胞，具有抗hiv感染的作用［4，5］。
趋化因子受体系统与机体免疫系统之间相互作用的复杂性，使得趋化因子抑制剂的体内作用的研究比较困难,而体外研究结果不能确切地反映体内的情况。有鉴于此,对广谱趋化因子受体抑制剂vmipⅱ的体内研究具有代表性。在本研究中，我们进行了食蟹猴静脉注射rvmipⅱ的长期毒性实验，观察各脏器、淋巴组织的病理学改变并检测了多项免疫指标，研究其对免疫系统的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 rvmipⅱ注射用原液和冻干粉针剂，rvmipⅱ抗原标准品（理化对照品）由暨南大学基因组药物研究所研制并通过国家药品和生物制品检定。125irvmipⅱ由中山大学实验核医学教研室标记。rvmipⅱ单克隆抗体、猴cd3/cd4/cd8单克隆抗体购自美国r&d公司。
1.2 实验动物及给药 食蟹猴24只，雌雄各半，由广东省肇庆市实验动物科技研究中心提供，年龄3～5岁，体重3.1±0.2 kg（雌），3.3±0.2 kg（雄）。动物观察2周，外周血有形成分指标、血液生化学和尿常规均符合要求。动物随机均衡分为4组，每组6只：阴性对照组及低、中、高剂量三个实验组，分别静脉注射人白蛋白（1%）或相应剂量的rvmipⅱ（50、250和1 250 μg/kg），每天1次，连续13周。观察期间连续监测记录受试动物一般状况、体温、心电图、尿常规及血液学指标。
1.3 样品采集 血液样品分别于给药前2周、给药后6周、13周以及恢复期2周取动物外周静脉血；各脏器以及淋巴器官样品于连续给药13周结束后24小时每组随机抽取3只动物, 以及恢复期2周（停止给药）后每组剩余3只动物, 麻醉后颈动脉放血处死获取。
1.4 各脏器和淋巴组织病理学检查 全面细致观察并记录各器官及淋巴组织的肉眼变化并作常规病理切片检查。脏器包括肾上腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、垂体、脊髓、前列腺、脑、延髓、心、脾、胸骨（骨和骨髓）、肾、肝、肺、淋巴结、膀胱、子宫、卵巢、甲状腺、胸腺、睾丸（附睾）、视神经和给药部位皮肤。淋巴组织包括淋巴结、脾脏、胸腺和小肠黏膜。
1.5 淋巴组织细胞凋亡检测 取上述淋巴组织石蜡切片，按末端转移酶介导的缺口标记（tunel）法的试剂盒（武汉博士德公司）说明书进行凋亡细胞标记染色。以化疗后病人淋巴结切片作为阳性对照，如细胞核中有棕黄色颗粒，则判定为阳性。每张切片于光镜下计数10个视野（400×，104 μm2/视野）的阳性细胞百分率，取其平均数。
凋亡指数（ai）=10个视野凋亡细胞百分率平均数1个视野的面积。
1.6 elisa法测定食蟹猴血清rvmipⅱ的抗体滴度 按照间接elasa常规操作方法检测食蟹猴血清rvmipⅱ的igg抗体：rvmipⅱ标准品（1 μg/孔）包被酶标板，3%明胶封闭, 以rvmipⅱ单克隆抗体为阳性对照，正常猴(阴性对照组)血清为阴性对照，pbs为空白对照。食蟹猴血清样品做系列稀释, 每个样品三复孔。显色反应结束后，用酶标仪（biotke，elx800uv）测定a450。当样品孔a450/阴性对照a450≥2.1时，判断为rvmipⅱ抗体阳性。elisa可检测到阳性的抗体最大稀释度作为该样品的抗体滴度。
1.7 淋巴细胞转化实验 参照以前描述方法分离制备实验不同时期食蟹猴外周血单个核细胞(pbmc)［6］。细胞悬浮于rpmi1640培养基中（2×106 ml-1）与pha（sigma，100 μg/ml）共同培养72小时（37℃、5%co2），培养结束后做细胞涂片检查。以未经培养的阴性对照组pbmc（加入或不加入pha）作为对照。细胞涂片经瑞氏染色后油镜下观察。以过度型淋巴细胞、淋巴母细胞、核分裂相细胞作为转化细胞，计数100～200个淋巴细胞中的转化细胞。
淋巴细胞转化率=转化的细胞数淋巴细胞总数×100%。
1.8 cd3+、cd4+、cd8+t淋巴细胞测定 给药13周分离各组食蟹猴pbmc，细胞存活率＞90%。cd3、cd4、cd8单克隆抗体分别标记cd3+、cd4+、cd8+细胞，在facs calibur型流式细胞仪（美国becton drickinson公司）计数。
1.9 统计学处理 本实验数据采用spss软件处理，p＜0.05为显著性差异。
2 结果
2.1 rvmipⅱ长期静脉注射对食蟹猴血液学指标的影响 观察期间各组动物一般状况、体温、心电图、尿常规及血液生化指标均无明显异常。外周血有形成分检查显示：低剂量组动物各项指标均在正常范围内；与阴性对照组相比，中、高剂量组动物外周血淋巴细胞总数和分类在给药6、13周时显著性增高（p＜0.05），恢复期2周中剂量组恢复至正常范围，见表1。
2.2 rvmipⅱ长期静脉注射对食蟹猴外周血t淋巴细胞亚群的影响 13周外周血pbmc中cd3+/cd4+/cd8+t细胞百分数测定显示，低剂量组无显著改变，中、高剂量组显著性增加（p＜0.05），增加与剂量呈依赖关系，同时各组cd4+/cd8+比值均在正常波动范围内，见表2。
2.3 rvmipⅱ长期静脉注射引起的食蟹猴淋巴器官组织学改变 rvmipⅱ连续静脉注射13周，实验组动物所有受检脏器均未发现病理学改变，淋巴器官则出现增生并呈现剂量依赖效应：低剂量组无增生；中剂量组淋巴结淋巴滤泡增生；高剂量组动物淋巴结淋巴滤泡、脾白髓、胸腺、小肠黏膜固有层淋巴滤泡均出现增生，后者并伴有较明显的生发中心扩大，见图1。恢复期第2周与第13周相比，增生程度显著性减轻。
2.4 rvmipⅱ长期静脉注射引起的食蟹猴增生淋巴组织细胞凋亡指数 阳性对照（肿瘤化疗病人淋巴组织切片）凋亡细胞呈典型凋亡细胞形态，ai=37.0±0.8个/104 μm2。第13周，1 250 μg/kg剂量组食蟹猴淋巴组织平均凋亡指数为4.8±0.8个/104 μm2，阴性对照组为3.9±0.8个/104 μm2。两组凋亡指数之间无显著性差异，见表3。
2.5 rvmipⅱ对食蟹猴的免疫原性 rvmipⅱ连续注射第6周至恢复期第2周，食蟹猴血清均可检测到rvmipⅱ抗体。第13周各实验组动物血清的抗体滴度依次为1∶1、1∶2和1∶4，恢复期第2周，血清抗体水平呈下降趋势（p＜0.05），见图2。
2.6 rvmipⅱ长期静脉注射引起的淋巴细胞转化率的变化 rvmipⅱ连续静脉注射第6、13周，各试验组动物淋巴细胞转化率均显著性增高（p＜0.05），并且在恢复期第2周恢复至正常水平，见表4。
表1 rvmipⅱ连续给药13周期间食蟹猴外周血淋巴细胞总数的改变（略）
tab.1 changes of cynomolgus macaque peripheral blood total lymphocytes calculation in the 13th week after intravenous administration
note:compared with negative control,1) p＜0.05.
表2 rvmipⅱ连续静脉给药13周对食蟹猴外周血t淋巴细胞亚群的影响（略）
tab.2 effects of rvmipⅱ on cynomolgus macaque peripheral t cell subfamilies in the 13th week after intravenous administration
note:compared with negative control,1) p＜0.05.
图1 rvmipⅱ(1 250 μg/kg)连续静脉注射13周后食蟹猴淋巴组织的增生（略）
fig.1 hyperplasia in cynomolgus macaque lymph node follicular(a), thymus follicular(b) and spleen white pulp(c) after 1 250 μg/kg rvmipⅱ continuous administration for 13 w
note:a, b×40，c×100，h.e.
表3 增生的淋巴组织细胞凋亡指数（n=3）（略）
tab.3 comparison between various hyperplastic lymphoid tissues ai(n=3)
图2 rvmipⅱ连续静脉给药13周食蟹猴血清rvmipⅱ抗体的elisa测定（略）
fig.2 determination of rvmipⅱ antibody in cynomolgus macaque serum by elisa during the period of rvmipⅱ continuous administration for 13 w
表4 rvmipⅱ长期静脉给药期间食蟹猴的淋巴细胞转化率（略）
tab.4 lymphocytes transformation ratio during the period of rvmipⅱ longterm intravenous administration
note:compared to preadministration,1) p＜0.05.
3 讨论
食蟹猴静脉连续给药13周后的rvmipⅱ抗体检测，说明rvmipⅱ对食蟹猴的免疫原性较弱，在大剂量连续给药的条件下并没有诱发强烈的体液免疫反应。我们在实验中意外地发现在长期大剂量静脉注射rvmipⅱ后，食蟹猴各淋巴组织都出现了不同程度的增生，增生的淋巴组织原位细胞凋亡不明显， 但伴有外周血淋巴细胞转化率增加、pbmc中t细胞（cd3+细胞）及其亚群（cd4+、cd8+细胞）百分数增加而cd4+/cd8+比值未见明显变化等细胞免疫功能增强指标的改变。上述研究结果表明rvmipⅱ对机体免疫系统的影响不是单纯的刺激增生作用，是一种以引起t细胞增生为主同时增强细胞功能的综合作用。
我们观察到的淋巴组织增生在组织学上类似于刺激反应性增生，没有明显的病理学变化，与体外研究结果不十分相符。vmipⅱ抑制细胞黏附、趋化的体外研究已有较多报道，但至今尚未发现其具有直接刺激靶细胞增生的作用［7］。目前研究已经证实内源性趋化因子及其受体在t、b细胞的形成过程中十分重要的调控作用，如sdf1可以诱导b细胞从骨髓中转移至脾和其它淋巴组织，在那里完成分化和成熟［8］；mip1α和ratens对t细胞的增殖分化和细胞因子的分泌也具有巨大影响。因此rvmipⅱ引起体内淋巴组织增生的原因，我们推测可能有以下三方面：
①淋巴细胞出巢增多：多数趋化因子受体抑制剂与受体结合后，抑制受体正常的内化循环途径，使细胞表面受体密度降低［9］。我们推测vmipⅱ引起淋巴组织增生可能由受体表达量降低导致淋巴细胞出巢增多造成的。同时，增生淋巴组织原位细胞凋亡指数没有明显改变也支持这一推论。
②多种趋化因子受体的综合作用：在淋巴细胞发育过程中，一方面趋化因子受体的表达谱变化是多变的，另一方面，rvmipⅱ所结合的广谱趋化因子受体对机体淋巴系统的作用也是极其复杂的［10］。研究人员推测vmipⅱ使细胞表面的cxcr4表达量减少从而促进细胞的分化和功能的成熟［11］。我们在本研究中观察到的食蟹猴淋巴系统增生是rvmipⅱ与这些受体相互作用的综合结果。
③慢钙流信号转导途径的影响：与其他已知的趋化因子受体抑制剂不同，rvmipⅱ能够引起细胞慢钙内流，很可能这就是rvmipⅱ长期静脉注射引起淋巴组织增生的主要原因。一般认为趋化因子的趋化性是与快速钙内流相关，因此rvmipⅱ对靶细胞没有明显的趋化效应，很可能与趋化因子受体结合后形成了非趋化性的其它信号转导途径，因而刺激了免疫系统的增生。
本研究报道了广谱趋化因子受体抑制剂rvmipⅱ大剂量长期静脉注射在体内引起广泛的淋巴组织增生的现象。vmipⅱ的受体抑制作用可能提示了一类特殊的t细胞增生成熟机制，这一机制值得进一步深入研究，是否与vmipⅱ引起特殊的细胞慢钙流有关仍需进一步证实。
【参考文献】
1 baggiolini m, dewald b, moser b. human chemokines: an update ［j］. ann rev immunol,1997;15:675705.
2 kremlev s g, roberts r l, palmer c. differential expression of chemokines an chemokine receptors during microglial activation and inhibition ［j］. j neuroimmunol,2004;149(12):19.
3 renne r, dittmer d, kedes d et al. experimental transmission of kaposi’s sarcomaassociated herpesvirus(kshvhhv8) to sivpositive and sivnegative rhesus macaques ［j］. j med primatol,2004;33(1):19.
4 kledal t n, rosenkide m m, coulin f et al. a broadspectrum chemokine antagonist encoded by kaposi’s sarcomaassodiated herpesvirus ［j］.science,1997;277(5332):16561659.
5 boshoff c, endo y, collins p d et al. angiogenic and hivinhibitory functions of kshvencoded chemokines ［j］.science,1997;278(5336):290294.
6 孙晗笑，杨滨燕，李 波 et al. 内源性il12决定人pbmc产生干扰素γ的水平 ［j］.中国免疫学杂志，2002；18（4）：228232.
7 nakano k, isegawa y, zou p et al. kaposi’s sarcomaassociated herpesvirus(kshv)encoded vmipⅰ and vmipⅱ induce signal transduction and chemotaxis in monocytic cells ［j］. arch virol,2003;148(5):871890.
8 d’apuzzo m,rolink a, loetscher m et al. the chemokine sdf1, stromal cellderived factor 1, attracts early stage b cell precursors via the chemokine receptor cxcr4 ［j］.eur j immunol,1997;27(7):17881794.
9 hillyer p, mordelet e, flynn g et al. chemokines, chemokin receptors and adhesion molecules on different human endothelia: discriminating the tissuespecific functions the affect leucocyte migration ［j］. clin exp immunol,2003;134(3):431441.
10 mackay c r.chemokines:immunology’s high impact factors ［j］. nat immunol,2001;2(2):95101.
11 luther s a, cyster j g. chemokines as regulators of t cell differentiation ［j］.nat immunol,2001;2(2):102107.
