【摘要】 目的： 探讨核糖体s6激酶（p90rsk）调节肝星状细胞（hsc）ⅰ型胶原表达的作用. 方法： 将设计的p90rsk特异性sirna克隆至真核表达载体pavu6+27中，构建p90rsk的rna干扰真核表达载体pavrski. 将构建的pavrski通过脂质体瞬时转染hsct6，分别采用实时定量聚合酶链式反应和western blot方法检测细胞的p90rsk和ⅰ型胶原mrna和蛋白表达. 将p90rsk的真核表达质粒（pmt2rsk1）和pavrski分别与ⅰ型胶原启动子荧光素酶报告基因质粒（pgl3col1a1）共转染原代hsc，48 h后检测细胞的荧光素酶活性. 结果： 构建的pavrski能够有效抑制hsct6中p90rsk mrna和蛋白表达，与对照组相比较分别减少了（70.20±4.04）%和（89.10±5.26）%（p<0.01）. hsct6中ⅰ型胶原的mrna和蛋白的表达，与对照组相比较分别减少（61.80±3.96）%和（98.50±7.01）%（p<0.01）. 各组转染pmt2rsk1，pavrski和空载质粒的hsc中，ⅰ型胶原启动子活性之间的差异无统计学意义（p>0.05）. 结论： p90rsk参与了hsc中胶原的表达调控，可能成为肝纤维治疗的新靶点.
【关键词】 核糖体蛋白质s6激酶类；肝/细胞学；星形细胞；胶原ⅰ型；rna干扰
0引言
核糖体s6激酶（90kda ribosomal s6 kinase, p90rsk）隶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，是细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase 1 and 2, erk1/2）信号转导通路的重要效应分子，具有在多种细胞内调控基因转录、细胞周期以及维持细胞生存等生物活性［1-2］，在肿瘤的发生及神经系统发育中具有重要的调控作用［3］. 活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell, hsc）是肝纤维化时细胞外基质的主要来源和发生、发展的中心环节［4］. 研究［5-6］表明p90rsk在肝纤维化中表达增加，并参与诱导hsc的凋亡. 然而p90rsk是否参与调节hsc内胶原的表达及其可能机制，目前国内外尚少见报道. 本实验采用rna干扰、报告基因等技术，研究hsc内p90rsk调节胶原表达及其分子机制，为临床治疗肝纤维化提供新的思路.
1材料和方法
1.1材料雄性sd大鼠250～300 g（南京军区南京总医院实验动物中心）；pmt2rsk1由美国哈佛大学医学院avruch教授惠赠. pavu6+27由美国密歇根大学生物化学实验室engelke教授惠赠. 携带大鼠ⅰ型胶原启动子及萤火虫荧光素酶基因的pgl3col1a1由东南大学实验中心提供. 肝星状细胞株hsct6由美国西奈山大学肝脏中心实验室friedman教授惠赠，其表型为活化的hsc. 小鼠抗大鼠rsk抗体（美国bd 公司）；兔抗大鼠ⅰ型胶原抗体（武汉博士德公司）；荧光素酶检测试剂盒（美国promega公司）；ck40型电转化仪，icyclertm 光学荧光定量pcr仪，pac3000蛋白电泳仪，半干转膜仪（美国biorad公司）；ck40倒置显微镜（日本olympus公司）；聚偏二氧乙烯膜（pvdf）（美国schleicher & schuell公司）；lipofectaminetm2000试剂（美国invitrogen公司）；牛血清白蛋白（美国sigma公司）.
1.2方法
1.2.1hsc原代细胞的分离培养大鼠称重后以戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，以10 u/l肝素钠1 ml/kg将大鼠肝素化，暴露门静脉，插管，以37℃无钙灌流液预灌流，40~50 ml/min，持续约10 min；其后用酶灌流液继续灌流，40~50 ml/min，持续时间为10~15 min. 取出肝脏，剪碎、消化、过滤，滤液离心，1700 r/min，离心7 min，弃上清，用dhanks清洗，1700 r/min，离心7 min；弃上清，沉淀以1∶2体积的180 g/l的nycodenz混匀，行密度梯度离心，3400 r/min，离心17 min；取界面处细胞，用dmem清洗2次，1700 r/min，离心7 min；取沉淀细胞悬浮于含200 ml/l小牛血清的dmem中，用台盼蓝染色判断存活率；将细胞以1×105/cm2接种于培养皿，置37℃，50 ml/l co2培养箱培养，24 h细胞贴壁后换液；倒置显微镜下观察所分离的hsc形态和培养后的形态变化；在荧光显微镜328 nm波长的紫外光激发下，观察hsc的自发荧光.
1.2.2rnai载体的构建及鉴定通过网站的sirna设计软件，设计针对大鼠p90rsk的特异性sirna：forward oligo：tcgacaaaagagatccctccgaagttcgcttcggagggat
ctctttttttt；reverse oligo：ctagaaaaaaaagtagatccctccgaagcgaacttcggagggatctcttt
tg ，由上海申友生物工程公司合成. 将合成的片段分别溶于双蒸水中，配制成100 pmol/l的溶液，将引物进行退火、磷酸化. pavu6+27空载质粒进行酶切线性化，并将酶切产物纯化后与合成的引物于16℃连接过夜后感受态细菌（dh5α）转化，构建p90rsk的特异性质粒pavrski，质粒抽提、酶切鉴定.
1.2.3hsc细胞转染应用lipofectaminetm2000试剂进行pavrski瞬时转染hsct6细胞株（表型为活化状态的hsc），以pavu6+27空载体作为对照. 转染当日，在1.5 ml离心管中以250 μl无血清、无抗生素的 dmem培养液稀释4 μg目的质粒，充分混匀. 同时，在另一1.5 ml离心管中以250 μl无血清、无抗生素的dmem培养液稀释10 μl脂质体，并于5 min内将其与dna稀释液混合. dna脂质体混合物在室温下放置30～45 min. 在此期间，以新鲜dmem培液（含有血清但无抗生素）洗涤细胞2次，然后加入1 ml相同培液. 将500 μl dna脂质体混合物加入6孔培养板中，前后摇动，使其充分混匀，放置于37℃，50 ml/l co2培养箱中培养. 在质粒转染12 h后加入等体积新鲜含血清培养基，转染24～48 h后收集细胞进行目的基因的实时定量pcr和western blot检测.
共转染：在进行报告基因检测中，采用原代分离培养的hsc细胞. 各组细胞分别转染p90rsk的表达质粒（pmt2rsk1，1 μg），rna干扰质粒（pavrski, 1 μg），pgl3basic（1 μg,基础对照），pgl3control（1 μg，阳性对照）外，均再加入pgl3col1a1（1 μg）和prlsv40（0.1 μg，为内参）共转染，24 h后，弃去转染液，加入正常细胞培养液，继续孵育至48 h，进行荧光素酶活性检测.
1.2.4实时定量pcr检测p90rsk和胶原mrna的表达提取转染组和对照组细胞总rna，逆转录合成cdna模板，进行目的基因的pcr扩增，产物10-1倍比稀释，制备标准曲线样品. 采用荧光定量rcp仪分别扩增目的基因和内参基因，测定标准曲线和熔解曲线，用ct值表示样品中模板的相对含量. 荧光定量rcp的反应体系与条件：25 μl反应体系，正、负引物（10 μmol/l）各0.5 μl，takara 2×pcr master mix 12.5 μl，模板1.0 μl，加水补足. 预变性94℃ 2 min，94℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 20 min，共40个循环. 产物熔解曲线测定条件为：95℃ 1 min，72℃ 1 min，每升高0.5℃保持30 s，至95℃. rtpcr使用的正向引物（f）和反向引物（r）包括：p90rsk（f）tctctgtccagcggcgggtgagga；p90rsk（r）gcattcacagcgcccatgcgcag；collagenⅰ（f）ccagccgcaaagagtctacatgtc；collagen ⅰ（r）itcaccttctcatccctcctaa；18 srna（f）gtctgtgatgcccttagatg；18srna（r）agcttatgacccgcacttac.
1.2.5western blot检测p90rsk和胶原蛋白的表达吸去细胞培养液，1×pbs（0.01 mol/l, ph7.4）洗涤后加入裂解液［（10 mmol/l tris(ph7.5~8.0), 25 mol/l nacl, 10 ml/l tritonx100, 10 g/l protease inhibitor）］冰上放置20 min后收集裂解液，4℃，13 000 g,离心30 min，收取上清，进行福林酚法蛋白定量. 取20 μg蛋白样品行聚丙烯酰胺凝胶（50 g/l沉积胶，100 g/l分离胶）电泳分离样品，转印至pvdf膜. 50 ml/l牛血清白蛋白，4℃封闭过夜后，一抗（1∶1000稀释）室温孵育3 h，pbst充分洗涤后加入二抗（1∶5000稀释）室温孵育2 h，pbst充分洗涤，鲁米诺和增强子（ecl plus）室温孵育2 min后kodak增感胶片曝光检测. 以βactin为内参照.
1.2.6荧光素酶报告基因活性检测转染48 h后，以pbs洗涤细胞2次，每孔细胞加入1×reporter lysis，离心收集上清，取20 ml上清按照检测试剂说明书操作，用化学发光检测仪检测荧光素酶的活性.
统计学处理：采用spss11.0统计软件进行方差分析，数据以x±s表示. p<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1p90rskrnai真核表达载体的构建空载质粒pavu6+27的酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，在300 bp附近可见一条带，而干扰质粒pavrski的酶切产物经15 g/l琼脂糖凝胶电泳，在350 bp附近可见一条带（图1），并将酶切产物纯化后测序鉴定，说明含52 bp sirna的p90rskrnai真核表达载体构建完成.
2.2p90rskrnai对hsc中ⅰ型胶原mrna表达的影响实时定量pcr结果显示，转染pavrski后，hsc的p90rsk mrna的表达与对照组比较减少了（70.20±4.04）%，ⅰ型胶原mrna的表达与对照组比较减少了（61.80±3.96）%（p<0.01），两者表达变化方向一致.
2.3p90rskrnai对hsc中ⅰ型胶原蛋白表达的影响western blot检测结果显示，转染pavrski后，hsct6的p90rsk和ⅰ型胶原的蛋白表达较对照组减少了（89.10±5.26）%和（98.50±7.01）%（p<0.01），两者表达变化方向一致（图2）.
2.4p90rskrnai对hsc中ⅰ型胶原启动子活性的影响转染pgl3basic,pgl3control,pmt2rsk1,pmt2,pavrski,pavu6+27质粒的hsc荧光素酶的相对活性分别为（0.92±0.12），（5.63±0.69），（1.61±0.35），（0.31±0.08），（0.63±0.10），（0.42±0.09），各组与对照组之间的差异无统计学意义（p>0.05）.
3讨论
近年来，关于hsc中信号转导通路的研究表明，erk1/2信号转导通路与hsc的增殖及胶原合成密切相关［7］. p90rsk是erk1/2信号转导通路下游重要的效应分子，是蛋白磷酸化的主要执行者，在多种细胞中参与调节基因转录、蛋白翻译、细胞周期以及细胞生存等. buck等［8］ 的研究表明，p90rsk通过磷酸化作用抑制hsc凋亡盒形成，从而抑制细胞的凋亡，促进肝纤维化的发生. p90rsk在活化的hsc中表达增加，并与胶原表达之间存在明确的相关性［5］. 本实验通过rna干扰技术进一步研究p90rsk在hsc内调节ⅰ型胶原表达的功能. 结果表明，实验设计的rna干扰质粒特异性抑制了hsct6中p90rsk基因的表达，同时也相应地抑制了ⅰ型胶原的表达，两者的表达变化呈良好的正相关. 我们的研究证实，在hsc中p90rsk对ⅰ型胶原具有表达调控作用，针对p90rsk的rna干扰可有效的降低胶原的表达，可望成为肝纤维化的基因治疗手段. 在肝纤维化发生中，各种细胞因子等可以通过改变hsc的增殖活性或分泌活性这两种重要的方式来调节胶原的表达［9］. hsc最强效的促增殖因子（pdgf）和促胶原合成因子(tgfβ)均可以激活erk1/2通路参与肝纤维化过程. buck等［6］报道p90rsk通过活化c/ebpβ可以抑制hsc的凋亡，促进胶原的形成以及纤维化的发生，与我们前期有关erk1/2的研究结果一致［10］.
综上所述，本研究报告基因活性的分析研究结果表明，在hsc中p90rsk的表达变化对ⅰ型胶原启动子的活性并无明显影响，提示p90rsk在转录水平没有调控胶原基因表达功能，但其在胶原的转录后以及蛋白水平的调控作用仍有待进一步的研究证实.
致谢在此诚挚感谢第二军医大学长征医院消化内科谢渭芬教授和上海国家人类基因组南方研究中心张新教授的技术指导和大力帮助.
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