【摘要】 目的：分离纯化鉴定兔高迁移率非组蛋白n2(high mobility group chromosomal protein n2, hmgn2)。方法：利用液氮研磨和5%高氯酸从新鲜兔胸腺组织获得酸溶性萃取物，经反相高效液相色谱（rphplc）分离得到hmgn2，经过sds聚丙烯酰胺凝胶电泳和westernblotting对hmgn2进行分子量测定和特异性鉴定。并利用琼脂糖弥散抑菌实验对其杀菌活性进行鉴定。结果：利用上述方法分离纯化出高纯度的兔hmgn2。对大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌atcc25922有明显杀菌活性。结论：建立简单分离高纯度的hmgn2的方法。
【关键词】 兔胸腺；hmgn2；分离
高迁移率非组蛋白(high mobility group chromosomal protein, hmg)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族[9]，这一家族的成员普遍存在于高等真核生物中，目前hmg蛋白分为三个亚家族，分别为hmga、hmgb和hmgn。hmgn2为hmgn亚家族的成员，其基因位于染色体1q35,相对分子质量为9.2kd，共由90个氨基酸组成。已有研究表明，hmgn2结合于染色体的特异部位，是染色体纤维构成必不可少的部分[2,3]，参与dna的复制和转录[1]，与转录活性基因有关[5]，能解开致密染色体的折叠结构从而有利于复制和转录的启动[6]。Www.11665.cOm本实验室首次发现hmgn2具有明显的抗菌活性[4]。为了进一步研究hmgn2的生物学功能，我们利用琼脂糖弥散抗菌法鉴定内源性抗菌肽的方法，分离纯化兔胸腺hmgn2。
1 材料和方法
1.1实验材料
主要材料:兔胸腺，致病性大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌atcc25922。主要试剂:丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，temed，蛋白质marker为merck产品；tris、tricine、琼脂糖、大豆培养基、三氟乙酸、溶菌酶、牛血清白蛋白（bsa）为simga产品；乙腈为fisher产品；抗hmgn2多克隆抗体为upstate产品；色谱纯水为millipore超纯水；考马斯亮兰r250为上海试剂厂进口分装产品；反应试剂盒bca protein assay kit为pierce公司产品；其余试剂为国产分析纯。主要仪器：高速离心机（beckman coulter avanti j30i,美国）、反相高效液相色谱仪hp1100(惠普公司)、电泳装置为（biorad power/pac3000美国）、uvi凝胶成像系统（英国）。
1.2实验方法
1.2.1兔胸腺酸溶性萃取物的制备新鲜兔胸腺组织，剪碎，液氮研磨。研磨产物溶于5%高氯酸，冰浴电动匀浆提取酸溶性萃取物，萃取物在3.5kd的透析袋中4℃透析48小时后冷冻干燥，得兔胸腺核蛋白的粗提物[8,7]。放于-70℃保存用于备用。
1.2.2 反相高效液相色谱分离纯化兔胸腺酸溶性粗提物兔胸腺核蛋白粗提物冷冻干燥后溶于0.1%的三氟乙酸，高速离心后上清液用于rphplc经c18柱分离纯化。所用分离条件为：0.1%的三氟乙酸→60%乙晴060分钟线性梯度洗脱，检测波长为214 nm,流速为1 ml/min。收集每个单峰的洗脱液，真空冷冻干燥后溶于无菌水中进行鉴定。
1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳（tricinesdspage）及尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（aupage）初步鉴定hmgn2 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳初步确定上述各单峰的相对分子量，以及其纯度，所用浓缩胶浓度为4%t、3%c,分离胶浓度为16.5%t、3%c。胶厚0.75nm。电泳条件: 80v恒压,3.54小时。电泳完毕后进行考马斯亮蓝染色1小时,脱色过夜后进行观察。
1.2.4 western blotting特异性鉴定hmgn2tricinesdspage电泳完毕后，利用半干转移法将胶上条带转移到pvdf膜上，10%bsa封闭1小时膜后，加入hmgn2抗体4 ℃孵育过夜，次日漂洗后用辣根过氧化酶标记的抗兔igghrp室温孵育1小时后，洗涤三次，pvdf膜蛋白面向上，dab显色液显色后观察试验结果。
1.2.5 hmgn2对大肠埃希菌的杀菌功能鉴定参照lehrer等[14]的方法对hmgn2的抗菌功能进行检测:用pbs作为阴性对照，hnp为阳性对照，hmgn2的稀释浓度依次为4、2、1、0.5 μg·μl1。37 ℃孵育过夜，观察杀菌环直径大小判断杀菌功能强弱。实验做三复孔，重复三次。
2 实验结果
2.1hmgn2分离纯化及鉴定
新鲜兔胸腺组织酸溶性粗提物经rphplc分离后各组分出峰时间如图1所示，主要色谱峰集中在2040分钟。第20分钟的分离物为兔胸腺hmgn2。图2显示经rphplc所得的第二十分钟分离物行tricinesdspage电泳后考马斯亮蓝染色分析结果，可见其分子量介于14和18之间。图3所示为western blotting特异性鉴定hmgn2经dab显色液显色后结果。
2. 2hmgn2杀菌功能鉴定
结果见表1,hmgn2样品浓度为4 μg·μl1，点样量为5 μl，每组实验重复三次，表内显示hmgn2对大肠埃希菌有抑菌活性，抑菌直径（d）d≥8mm为＋＋＋。表1 hmgn2对大肠埃希菌的抑菌作用
3 讨论
hmgn2作为hmg三大家族的一员，是进化保守的，因其分子量小，聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移快速而得名。因其含量丰富，学者们对它的研究也是极其广泛的。早在80年代就有不少学者从牛，鼠，兔等动物中分离提纯出hmgn2，并且对它的生物学活性进行了充分的研究，发现它不仅与维持染色体的结构[10]、细胞的功能、基因的转录和活化过程[11,12]有密切关系外，随后发现其具有很强的杀菌功能[13]。而且因为抗菌肽的杀菌机制完全不同于传统的抗菌药物，因此hmgn2的抗菌机制也受到广大学者的关注。随着研究的深入，目前对其在细胞免疫和抗病毒功能上的研究也日趋增多，本实验室首次从兔胸腺利用液氮研磨，高氯酸萃取，反相高压液相色谱纯化的方法分离提纯出高纯度的hmgn2，为下一步对其抗菌机制的研究奠定基础。
【参考文献】
1 k.l. west. hmgn proteins play roles in dna repair and gene expression in mammalian cells[j].biochemical society transactions, 2004,32(6):918-919.
2 bustin m. chromatin unfolding and activation by hmgn (*) chromosomal proteins[j]. trends biochem sci, 2001, 26 (7): 431-437.
3 tetsuya ueda, yuri v. postnikov, and michael bustin1. distinct domains in high mobility group n variants modulate specific chromatin modifications[j]. biol.chem, 2006, 281 (15): 10182-10187.
4 feng y, huang n ,wu q , et al . the helic domain is essential for antibacterial activity of high mobility group nucleosomal binding domain 2( hmgn2)[j]. acta pharmacol sinica, 2005, 26 (9): 1087 - 1092.
5 刘庆俐,何开玲. hmg17非组蛋白与转录活性基因的关系[j].生物化学杂志，1990, 6（6）：549－552.
６ vestner b, bustinm, gruss c. stimulation of replication efficiency of a chromatin template by chromosomal protein hmgn2[j]. j biol chem, 1998, 273（8）: 9409-9414.
7 robert c. f, andrejs e. avotsavotins, et al. evidence for pilimediated adherence of klebsiella pneumoniae to rat bladder epithelial cells in vitro[j]. infection and immunity,1979, 25(2): 729-737.
8 bustin m, becerra ps, crippa mp, et al . recombinant human chromosomal proteins hmg214 and hmg217[j]. nucleic acids res.1991, 19(11): 3115 - 3121.
9 bustin m, reeves r. high mobility group chromosomal proteins: architectural components that facilitate chromatin function[j]. prog.nucleic acid res.mol.biol. 1996, 54（16）: 35-100.
10 marta prymakowskabosak, tom misteli. mitotic phosphorylation prevents the binding of hmgn proteins to chromatin[j]. molecular and cellular biology, 2001, 21(15): 5169-5178.
11 lillian medina, robert s. haltiwanger, calf thymus high mobility group proteins are nonenzymatically glycated but not significantly glycosylated[j].glycobiology,1998, 8(2): 191-198.
12 crippa mp, trieschmann l, alfonso pj, et al. deposition of chromosomal protein hmg17 during replication affects the nucleosomal ladder and transcriptional potential of nascent chromatin[j]. embo j. 1993, 12: 3855-386.
13 yun feng, ning huang, qi wu, boyao wang. hmgn2: a novel antimicrobial effector molecule of human mononuclear leukocytes?[j]. leukocyte biology. 2005, 78:1136-1141.
14 lehrer ri, rosenman m, harwig ssl, et al. ult rasensitive assays for endogenous antimicrobial peptides[j ] . j immunol meth. 1991, 137 : 167 - 171.
