【摘要】 目的 探讨硫化氢对大鼠肺缺血再灌注氧化损伤的影响。方法 以硫化氢钠(nahs)作为硫化氢供体。50只健康sd大鼠，随机分成假手术组、肺缺血再灌注组及硫氢化钠(nahs)组，后者进一步分为nahs 10、20、30μmol·kg-13个剂量组；每组10只。nahs组实验前5 d开始每天按体重分别腹腔注射不同剂量的nahs,实验前15min再次给药；假手术组和肺缺血再灌注组同时同方法给予生理盐水1ml·kg-1。建立大鼠在体肺缺血再灌注模型，实验结束时左心房放血处死大鼠，观察肺组织病理改变，测定肺湿/干重（w/d）值及肺组织匀浆内丙二醛（mda）、髓过氧化物酶（mpo）含量及超氧化物岐化酶（sod）、谷胱甘肽过氧化物酶（gshpx）活性。结果 肺缺血再灌注组肺组织w/d值、mda、mpo水平均较假手术组明显升高（p<0.01），而nahs组上述指标高于假手术组但低于肺缺血再灌注组（均p<0.05）；肺缺血再灌注组肺组织sod、gshpx活性较假手术组明显降低（p<0.01），nahs组上述指标低于假手术组但明显高于肺缺血再灌注组（p<0.05或p<0.01）。上述指标在nahs 3个剂量组间的差异无统计学意义。肺组织病理学检查结果显示，nahs组肺缺血再灌注损伤减轻。结论 硫化氢具有一定的抗大鼠肺缺血再灌注氧化损伤的能力，其作用机制与清除氧自由基及增加内源性抗氧化酶活性有关。
【关键词】 肺缺血再灌注损伤；硫化氢；硫氢化钠；氧自由基；氧化损伤
impact of hydrogen sulfide on oxidative damage in lung of rats after
ischemiareperfusion
yin yajun1,liu zhiyong2(1.school of clinical medicine，southeast university,nanjing 210009,china;2.department of cardiothoracic
surgery,zhongda hospital，southeast university,nanjing 210009,china )
abstract:objective to explore the impact of hydrogen sulfide(h2s) on oxidative damage in lung of rats after ischemiareperfusion.methods we used sodium hydrosulfide(nahs) as the donor of h2s.fifty sd rats were randomly divided into sham group（n=10）,lung ischemiareperfusion group(ir group,n=10) and ir+nahs group,and the ir+nahs group was divided into ir+nahs 10μmol·kg-1 group（n=10）,ir+nahs 20 μmol·kg-1 group（n=10）,ir+nahs 30μmol·kg-1 group(n=10).five days before the experiment,rats of ir+nahs(10μmol·kg-1,20μmol·kg-1and 30μmol·kg-1) groups were pretreated(intraperitoneal injection) with different dose of nahs according to the weight,and administration again 15 min before the experiment;sham group and ir group were pretreated(intraperitoneal injection) with normal saline(1ml·kg-1).an rat lung i/r model was built in vivo.at the end of the experiment,all rats were put to death after blood was collected from left atrium.we examined indices of lung injury:lung histological change,ratio of lung wet weight to dry weight (w/d),malondialdehyde(mda) and myeloperoxidase(mpo) content,activities of superoxide dismutase(sod) and glutathione peroxidase(gshpx) in lung tissues.results the w/d ratio of lung tissue,contents of mda and mpo in lung tissue in the ir group and ir+nahs groups were significantly higher than those in the sham group (p<0.05 or p<0.01),while the indices above in ir+nahs groups were significantly lower than those in the ir group(p<0.05);the activities of sod and gshpx in lung tissue in the ir group and ir+nahs groups were significantly lower than those in the sham group (p<0.05 or p<0.01),while the indices above in ir+nahs groups were significantly higher than those in the ir group(p<0.05 or p<0.01).all the indices abovementioned had no statistical significance in three dose of ir+nahs groups.the lung histological change also showed that preadministration of nahs could relieve lung ischemiareperfusion injury.conclusions these findings suggest that h2s has a certain ability of antioxidative damage in lung of rats after ischemiareperfusion.its mechanism involves oxyradical elimination and increase the endogenous antioxidant enzyme activity．
key words:lung ischemia reperfusion injury;hydrogen sulfide;sodium hydrosulfide;oxygen free radical;oxidative damage
(modern medical journal，2009，37：184188)
肺缺血再灌注损伤（lung ischemia reperfusion injury,liri）通常发生于肺移植、肺血栓栓子切除术后、肺栓塞溶栓治疗及各种体外循环心脏直视术后，是术后早期导致呼吸功能障碍及死亡的重要原因。wwW.11665.cOm如何减轻缺血再灌注损伤一直是医学界研究的重点和难点。liri发生机制十分复杂，尚未完全阐明，目前研究认为,可能与氧自由基引起的氧化损伤、钙超载及中性粒细胞(pmn)引起的过度炎症反应等密切相关［1］，其中机体产生大量的超过机体清除能力的氧自由基(ofr)在肺缺血再灌注损伤的病程发展中起了主要作用［2］。
硫化氢(hydrogen sulfide, h2s)是近些年来继一氧化氮(no)和一氧化碳(co)之后人们发现的一种新的内源性小气体信号分子。研究已证实,h2s能减轻心、肝、脑和肠等脏器的缺血再灌注损伤，但有关h2s在liri中的作用的研究报道尚少见。本实验以硫化氢(h2s)供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide,nahs)作为预适应药物，建立大鼠在体liri模型，观察其对肺缺血再灌注氧化损伤的影响，初步探讨其作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
健康sd大鼠50只（东南大学医学院实验动物中心提供），体重250～300 g，雌雄不拘；nahs（美国sigma公司）；小动物呼吸机（inspira asvp型,美国harvard公司）；丙二醛(malondialdehyde,mda)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,gshpx)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,mpo)检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），余试剂均为国产分析纯产品。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及模型建立 50只大鼠随机分成以下5组，假手术组、肺缺血再灌注组及nahs组，后者进一步分为10、20、30 μmol·kg-13个剂量组；每组10只。nahs组实验前5 d始每天按体重分别腹腔注射不同剂量的nahs，实验前15 min再次给药；假手术组和缺血再灌注组同时同方法给与生理盐水1 ml·kg-1。
各组大鼠用1％戊巴比妥钠（40 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，手术过程中可适量追加戊巴比妥钠，每次5 mg。颈部气管切开，插管接小动物呼吸机（调节呼吸频率70～80 次·min-1，潮气量10 ml·kg-1）。经胸骨右缘第3～5肋间开胸，撑开器暴露右肺组织，大鼠尾静脉注射肝素（1000 u·kg-1），离断右肺下韧带，用手术刀柄轻轻翻开右肺，暴露并游离右肺门；假手术组不阻断右肺门，持续灌注165 min，其余各组在吸气末用无创伤血管夹阻断右肺门45 min后去除血管夹，右肺组织通气再灌注120 min［3］。实验结束后左房放血处死大鼠。
1.2.2 肺组织湿/干重(w/d)值测定 取右肺中叶部分组织，滤纸吸尽表面液体，电子天平称取湿重，后置入80℃的烤箱中，48 h后称取干重，两者之比为肺湿/干重值。
1.2.3 肺组织匀浆中mda、sod含量及gshpx、mpo活性的测定 右肺下叶取部分组织-80℃保存，待所有动物实验结束后，将肺组织制成10％生理盐水匀浆，4℃ 下3000 r·min-1离心10min，取上清，考马斯亮蓝蛋白测定法检测肺组织匀浆液中蛋白浓度，按试剂盒操作说明，分别检测mda、sod含量及gshpx、mpo活性。
1.2.4 病理学检查 右肺下叶剩余肺组织用10％甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，苏木精伊红(he)染色，光镜下观察肺组织形态学改变。
1.3 统计学处理
采用spss16.0统计学软件进行统计学分析，实验数据以x-±s表示，对实验数据行方差分析和t检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 肺组织病理学改变
见图1
光镜下见：假手术组肺组织肺泡间隔未见增厚，无炎细胞浸润，肺泡腔内无渗出物（图1a）；肺缺血再灌注组肺组织结构不清，肺泡腔内充满大量渗出物，部分有红细胞漏出及坏死脱落的上皮细胞，肺泡间隔破坏，伴有少量单核细胞浸润（图1b）；nahs 10μmol·kg-1组与肺缺血再灌注组相比，肺组织损伤减轻，肺泡腔渗出物基本消失，部分结构基本恢复正常，局灶性肺泡间隔略有增厚（图1c）；nahs 20μmol·kg-1组与肺缺血再灌注组相比，主要表现为肺泡腔渗出物基本消失，病变以局灶性肺不张为主（图1d）；nahs 30μmol·kg-1组与肺缺血再灌注组相比，肺组织损伤亦减轻，肺泡腔渗出物基本消失，可见局灶性肺不张及肺泡间隔增厚（图 1e）。
2.2 肺组织湿/干重（w/d）值
见表1。表1 各组大鼠肺组织w/d值比较与假手术组比较，*p<0.05,** p <0.01；与肺缺血再灌注组较，▲p<0.05
肺缺血再灌注组肺组织w/d值较假手术组显著升高（p<0.01），nahs各剂量组w/d值虽较假手术组有所升高（p<0.05），但均明显低于肺缺血再灌注组（p<0.05）；在3种nahs剂量组间肺组织w/d值的差异无统计学意义。
2.3 缺血再灌注肺组织内mda、mpo含量的测定
见表2。表2 各组大鼠肺组织匀浆中mda、mpo含量的比较与假手术组比较，*p<0.05,** p<0.01； 与肺缺血再灌注组比较，▲p<0.05
与假手术组相比，肺缺血再灌注组肺组织匀浆中mda、mpo含量均显著升高（p<0.01）；各nahs干预组肺组织匀浆中mda、mpo含量虽高于假手术组（p<0.05），但明显低于肺缺血再灌注组（p<0.05）；而在3种nahs剂量组间mda、mpo含量差异无统计学意义。
2.4 缺血再灌注肺组织内sod、gshpx活力的测定见表3。表3 各组大鼠肺组织匀浆中sod、gshpx活力的比较与假手术组比较，*p<0.05,** p<0.01;与肺缺血再灌注组比较，▲p<0.05,▲▲p <0.01
肺缺血再灌注组肺组织匀浆中sod活力较假手术组显著下降（p<0.01）；nahs各剂量组肺组织匀浆中sod活力虽然较假手术组低（均p<0.05），但明显高于肺缺血再灌注组（均p<0.05）；与假手术组相比，肺缺血再灌注组及nahs 30 μmol·kg-1组肺组织匀浆中gshpx活力均显著下降（p<0.01），另两种nahs剂量组肺组织匀浆中gshpx活力也较假手术组降低（均p<0.05）；但是nahs组肺组织匀浆中gshpx活力均高于肺缺血再灌注组（p<0.05或p<0.01）；sod、gshpx活力在nahs 3种剂量组间的差异无统计学意义。
3 讨 论
h2s是一种无色、具有臭鸡蛋气味的有毒气体，是造成水源和空气污染的主要污染物之一，人体过量吸入可引起多脏器功能损害甚至死亡。长期以来人们对其研究主要限于毒性作用，直至上世纪90年代中期，人们研究发现人体内源性h2s对神经系统的发育及其功能、消化道和血管平滑肌张力等均具有重要的调节作用。目前认为，h2s是近年来继no和co之后人们发现的一种新的内源性小气体信号分子。内源性h2s主要是由含硫氨基酸（l半胱氨酸）经多种酶促反应产生，其限速酶主要包括：胱硫醚β合成酶(cystathionineβsynase，cbs)、胱硫醚γ裂解酶(cystathionineγsplitting enzyme，cse)。cbs、cse的表达具有组织特异性，心、肺组织中内源性h2s主要由cse催化产生。h2s在体内以两种形式存在——未溶解的气体h2s（约占1／3）和hs-钠盐nahs(约占2/3)。nahs在体内可分解为na+及hs-，后者与体内h+结合生成h2s，h2s和nahs在体内形成动态平衡［4］。已有研究［57］表明,h2s在许多肺脏疾病的发病机制中起着重要的调控作用，诸如慢性阻塞性肺疾病(copd)、肺炎症性损伤及肺纤维化等。
liri可导致明显的生理、生化及组织学改变，包括肺血管阻力增加、氧合减弱、肺顺应性降低及肺毛细血管通透性增加等。肺组织w/d值是评价肺水含量及肺微血管损伤的常用指标。我们在实验中观察到，缺血再灌注后肺组织w/d值大大升高，nahs干预后w/d值较肺缺血再灌注组明显降低(p<0.05)；同时，肺组织病理切片结果表明,nahs组肺组织水肿及炎症变化程度均较肺缺血再灌注组明显减轻。这些均提示h2s可降低缺血再灌注后肺组织血管通透性，对肺缺血再灌注损伤有一定的保护作用。
目前认为，氧自由基(ofr)是引起器官缺血再灌注损伤的主要发病因素，主要包括超氧阴离子(o-2·)、羟自由基(oh·)及其活性衍生物如过氧化氢(h2o2)、单线态氧(1o2)等［8］。在正常情况下，ofr引发的组织损伤可被内源性抗氧化物质所抑制。但在缺血再灌注条件下，组织ofr产生过多，而抗氧化系统受到破坏，氧化/抗氧化系统失衡，机体积聚的大量ofr可攻击细胞膜脂质中多不饱和脂肪酸、蛋白质及dna等，使得脂质过氧化、蛋白质功能受损及dna链破坏，最终导致了组织损伤和细胞死亡。肺缺血再灌注时ofr主要由中性粒细胞“呼吸爆发”产生［9］。肺组织细胞膜上含有大量多不饱和脂肪酸，在缺血再灌注时极易受到ofr攻击。mda是最具代表性的脂质过氧化代谢终产物之一［10］。因此，其在肺组织中含量的高低是反映氧化损伤程度的重要标志。本实验结果显示，肺缺血再灌注组肺组织mda含量较假手术组明显升高，表明liri时，体内ofr的产生与清除失衡，肺组织内ofr增加，导致细胞及细胞器膜结构与功能破坏，最终引起了肺水肿、出血等损害。而应用nahs预处理后，mda含量虽较假手术组升高，但其幅度明显低于肺缺血再灌注组。提示h2s具有抗氧化损伤能力，能减轻ofr所引起的膜脂质过氧化，保护生物膜结构与功能。在liri发生与发展过程中，中性粒细胞的聚集、激活起重要作用。中性粒细胞氧化应激后可产生特异性酶mpo，其活性的高低可反映中性粒细胞的浸润程度，zanardo等［11］的研究结果表明，急性炎症时，内源性h2s具有下调致炎性细胞因子及细胞间黏附分子表达的作用，减轻白细胞的黏附与聚集。本实验中观察到，肺缺血再灌注组肺组织mpo活性较假手术组显著升高，各nahs预处理组mpo活性虽然高于假手术组，但均明显低于肺缺血再灌注组。提示提前腹腔注射h2s供体nahs可减轻缺血再灌注损伤肺组织中中性粒细胞的聚集与激活。
sod是机体有效清除ofr的重要活性酶之一，其可特异性清除o-·2，保护细胞免受损伤，在一定程度上可反映机体抗氧化能力的大小。gshpx几乎存在于机体的所有组织中,能特异性地催化还原性谷胱甘肽对h2o2的还原反应，对组织中产生的h2o2有较强的清除能力,可保护细胞膜免受过氧化物的刺激和损伤。我们的研究发现：肺缺血再灌注组sod和gshpx活性明显低于假手术组，nahs各剂量组sod和gshpx活性虽低于假手术组（p<0.05或p<0.01）但均较高于肺缺血再灌注组(p<0.05或p<0.01)。cse是gsh合酶的关键酶，有研究发现在缺血性疾病中cse基因表达增强［12］。本实验结果提示，h2s可以提高机体内源性抗氧化酶系统的活性，增加清除ofr的能力，从而减轻liri。
综上所述，内源性小气体信号分子h2s具有提高大鼠机体抗肺缺血再灌注氧化损伤的能力，可能主要是通过直接或间接清除机体部分ofr和增加机体内多种内源性抗氧化酶活性等作用实现的；然而，更确切的机制有待于进一步的研究。
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