【关键词】 鸡贫血病毒 凋亡素 克隆 测序
【摘要】 目的：为了寻找肿瘤特异凋亡蛋白，克隆鸡法氏囊组织中鸡贫血病毒apoptin蛋白的编码基因并进行序列分析. 方法：根据基因数据库资料设计合成引物,以成鸡法氏囊组织中提取的dna作模板，通过pcr获得了特异扩增产物,将其插入到pgemteasy载体并转染感受态e.colidh5α菌株,提取质粒经限制性内切酶酶切鉴定后，使用dna测序仪测定插入片段的dna序列. 使用dnasis分析软件分析所克隆的dna序列及其编码蛋白质，并与数据库中apoptin蛋白的编码基因相比较. 结果：序列分析表明，成功地克隆了鸡贫血病毒的apoptin基因，同基因数据库中的相关资料比较发现与山东报道的apoptin基因（genbank ay171617）的核酸序列一致，同鸡贫血病毒全基因序列中的apoptin序列（genbank af 313470）有6个核酸差异. 结论：apoptin编码基因的克隆为特异诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤奠定了基础.
【关键词】 鸡贫血病毒 凋亡素 克隆 测序
0引言
鸡贫血病毒(chicken anemia virus, cav)是由danenvan oorschot等［1］在1979年发现并能引起雏鸡贫血死亡的一种环状病毒.cav基因组长度约2.3 kb［2］,能分别编码vp1,vp2和vp3三种蛋白质. 其中vp3蛋白是功能蛋白质,由121个氨基酸组成，它包含两个富含脯氨酸的序列和两个带正电的区域，具有诱导被感染鸡血细胞凋亡的活性,是鸡贫血病毒的主要致病因子,根据此特性将该蛋白命名为凋亡素（apoptin）［3］. 在apoptin诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用机制研究方面已取得较大进展［4］, apoptin能特异性诱导肿瘤细胞和转化细胞调亡，其发生作用不依赖p53基因，而且不被bcl2过表达所抑制，因此这种apoptin可能成为一种很有前途的能选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡的药物.
本研究旨在从自然生长的家鸡法氏囊中分离、提取cav dna，通过pcr方法扩增cav的apoptin编码基因，将其插入克隆载体pgemt中,使用双脱氧终止法测定插入片段的dna序列，同genbank的数据库比较证实获得了cav的apoptin编码基因克隆，为研究apoptin治疗肿瘤奠定了基础.
1材料和方法
1.1材料4只低体质量（<1400 g），低产卵的3月龄雌鸡（购于西安市郊区某鸡场）;pgemt质粒、e.colidh5α（西安市华广生物工程有限公司实验室提供）. 耐热的taqdna聚合酶、各种限制性内切酶、dna聚合酶、t4 dna连接酶、蛋白酶k, dna mr标准，华美生物公司；e.colidh5α受体菌，华广生物工程公司.
1.2方法
1.2.1病毒dna提取将鸡颈静脉放血处死，立即分离法氏囊，置液态氮冷冻保存；取100 mg冷冻组织，在1 ml的匀浆缓冲液（50 mmol/l trishcl, 100 mmol/l nacl, 2 mmol/l edta, ph 8.0）中制备组织匀浆；取500 μl匀浆加入sds和蛋白酶k，使其终浓度分别为1和200 mg/l，37℃温育120 min消化组织蛋白，消化后加入等体积的酚和氯仿/异戊醇各抽提一次，收集上清液加入rnase，37℃温育60 min，再次用酚和氯仿/异戊醇各抽提，加入二倍无水乙醇沉淀，收集沉淀使用700 ml/l乙醇洗涤后干燥，使用100 μl te缓冲液溶解备用.
1.2.2引物的设计根据genbank发表的cav基因序列设计扩增引物. 正向引物5′cgg ccg gcg tgg gat gaa cga tct cca aga aga tac3′, 反向引物5′caa gct tca gtc tta tac gcc ttc ttg cgg ttc3′. 粗斜体表示在正向引物和反向引物的5′端加入的nae i 和hind iii酶切位点，在正向引物和反向引物中分别加入了cg和c保护碱基. 为了作apoptin同相关蛋白的融合表达在反向引物3′端删除了终止子.
1.2.3pcr反应将上述目的基因进行pcr扩增，反应参数为：94℃ 5 min预变性, 94℃ 60 s, 60℃ 60 s, 72℃ 90 s,循环30次后,72℃延长5 min；pcr产物的鉴定与回收及同线性载体pgemt连接、受体菌的转化按常规分子生物学方法进行.
1.2.4阳性重组子的筛选与鉴定转化菌涂在含氨苄青霉素的加入x gal和ipgt的lb平板上，挑取白色菌落，扩增后提取质粒，ecor i酶切后，琼脂糖凝胶电泳.
1.2.5序列比较分析选取阳性重组克隆，由上海基康公司帮助测定插入片段序列. 插入片段同cav apoptin基因序列的一致性和编码蛋白质的分析使用dnasis 2.5软件完成.
2结果
2.1pcr产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr扩增产物(366 bp)与目的片断相吻合（图1）.
2.2重组质粒pgemt/apoptin的酶切鉴定重组质粒pgemt/apoptin经ecorⅰ酶切琼脂糖凝胶电泳得到2659 bp和约400 bp(393 bp)的两片段, 后者与目的片断大小一致(图2).
2.3重组pgemt/apoptin质粒中的apoptin基因测序对获得的重组质粒进行dna序列测定，测定的结果表明插入片段与设计片段序列完全一致，无碱基突变和读码框移位.
2.4克隆apoptin编码基因分析同genbank af 313470比较，本研究克隆的cav apoptin基因序列有6个核酸变异；同文献报道的apoptin基因序列ay171617一致.
3讨论
apoptin是cav的vp3蛋白基因编码的一种蛋白质，这种蛋白能特异性地诱导肿瘤细胞和转化细胞调亡，因此人们也称其为凋亡素-apoptin,其发生作用不依赖p53基因，也不能被bcl2过表达所抑制，有可能成为研究肿瘤细胞凋亡和抗肿瘤药物很有用的一个靶分子.
为了证实克隆的基因是否为apoptin基因,将其与genbank数据库中相关基因进行比较,发现与genbank数据库中登录的46株cav的vp3基因的同源性至少为98%，证实了克隆的dna片段确为apoptin基因. 同时将克隆的vp3基因orf推导得到的蛋白质一级结构与genbank数据库中相关蛋白质进行比较，发现与genbank数据库中收录的29株cav的凋亡素氨基酸序列的同源性至少为82%. cav是一种比较保守的病毒［5］,目前仅发现一种血清型. 凋亡素分子的118位氨基酸,所有报道的序列中几乎一半为cys,一半为arg. 实验证明,这一变化对凋亡素活性影响似乎比较大,当这个位点的arg变成cys时,cav在传代细胞中的传代效率降低,而且将降低凋亡素的核定位能力,表现为存留在胞质中的凋亡素量将超过细胞核的量,进而将降低其诱导细胞凋亡活性. 我们克隆的vp3基因编码的蛋白质是118 arg，因此可能具有较强的诱导肿瘤细胞凋亡的活性. 凋亡素可能是通过一种与大多数功能蛋白质不同的作用机制来发挥其诱发肿瘤细胞发生凋亡作用的,凋亡素在发挥功能时可能并不以单体的形式存在,而是与其他成分结合,或与自身成分形成异源或同源多聚体来发挥其功能. leliveld等［6］将麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein, mbp)与凋亡素分子连接,构建了一个可溶性的重组凋亡素蛋白融合体(mbpapoptin),经反复试验证明mbpapoptin是一个由30～40个亚基组成的稳定、均一在体内有活性的球形多聚体复合物；zhang等［7］通过显微注射手段将mbpapoptin分别注射到肿瘤细胞和正常细胞中,结果证实mbpapoptin在肿瘤细胞中具有显著的效价和特异性,而在正常细胞中细胞抗原表位被保护,mbpapoptin汇集成高级聚集体,最终在细胞质中被蛋白酶降解而消失［8］. 由于vp3基因编码的凋亡素蛋白apoptin具有很高选择性，这些特性进一步增强了凋亡素作为抗肿瘤药物的安全性. 从而有望解决肿瘤治疗中高效性和特异性难于统一及易产生耐药性等难题. apoptin将是一种非常有前景的抗肿瘤制剂,它的开发利用必将会产生巨大的经济效益和社会效益.
【参考文献】
［1］ danenvan oorschot aa, van der eb aj, noteborn mh. the chicken anemia virusderived protein apoptin requires activation of caspases for induction of apoptosis in human tumor cells［j］. j virol, 2000, 74(15): 7072-7078.
［2］ phenix kv, meehan bm, todd d, et al. transcriptional analysis and genome expression of chicken anemia virus［j］. j gen virol, 1994, 75(pt 4): 905-909.
［3］ noteborn mh, todd d, verschueren ca, et al. a single chicken anemia virus protein induces apoptosis ［j］. j virol, 1994, 68(1): 346-351.
［4］ danenvan oorschot aa, zhang yh, leliveld sr, et al. importance of nuclear localization of apoptin for tumorspecific induction of apoptosis ［j］. j biol chem,2003,278(30):27729-27736.
［5］ zhang yh, kooistra k, pietersen a, et al. activation of the tumorspecific death effector apoptin and its kinase by an nterminal determinant of simian virus 40 large tantigen ［j］. j virol, 2004, 78(18): 9965-9976.
［6］ leliveld sr, dame rt, mommaas ma. apoptin protein multimers form distinct higherorder nucleoprotein complexes with dna［j］. nucleic acids res, 2003,31(16):4805-4813.
［7］ zhang yh, leliveld sr, kooistra k, et al. recombinant apoptin multimers kill tumor cells but nontoxic and epitope shielded in a normal cell specific fashion ［j］. exp cell res,2003,289(1):36-46.
［8］ pietersen am, vander eb mm, rademaker hj, et al. specific tumor cell killing with adenovirus vectors containing the apoptin gene［j］.gene ther,1999,6(5):882-892.
