e钙黏附蛋白及cdh1基因在肾细胞癌组织中的表达及临床意义
【关键词】 肾细胞癌;e钙粘连素;基因
【摘要】 目的 探讨肾细胞癌(rcc)组织及癌旁组织中e钙黏附蛋白及e钙粘连素(cdh1)基因的表达与rcc发病机制间的相关性。方法 rcc患者36例(rcc组)，男24例，女12例;分别取血液和肾癌组织标本。对照组36例为非肿瘤患者，男30例，女6例，取血液标本。癌旁组织标本为对照组，elisa方法测定血浆中cdh1定量，免疫组化方法检测肾癌组织及癌旁组织cdh1的表达情况。竞争性pcr方法半定量分析组织中cdh1表达。分析rcc临床特点与cdh1表达的关系。结果 rcc组血浆中cdh1(4.3±1.8)ng/ml较对照组(6.8±3.1)ng/ml低(p<0.05)。免疫组化显示肾癌组织中cdh1表达阳性率为36.1%(13/36)，癌旁组织中的表达阳性率为69.4%(25/36)，肾癌组织与癌旁组织中cdh1表达比较差异均有统计学意义(p<0.05)。肾癌组织cdh1总rna和mrna水平与癌旁组织比较差异有统计学意义(p<0.05)。结论 cdh1基因表达下调可能在肾透明细胞癌的发生中发挥重要作用。
【关键词】 肾细胞癌;e钙粘连素;基因
the expression and clinical significance of ecadherin and cdh1 gene in renal cell carcinoma bai xin,gao jiangang,hou sichuan,et al.department of urology surgery,qingdao municipal hospital,shandong,qingdao 266071,china
【abstract】 objective to investigate the correlation between the expression of ecadherin and ecadherin (cdh1) gene in the renal cell carcinoma (rcc) as well as adjacent tissues and the pathogenesis of renal cell carcinoma.methods the blood specimens and kidney tissue of 36 patients with rcc,including 24 males and 12 females,were collected,and the blood specimens in 36 patients without tumor,including 30 males and 6 females were collected.the adjacent tissue of renal cell carcinoma was used as control group. the elisa method was used to detect quantitatively the plasma levels of cdh1,and immunohistochemical method was used to determined the expression of cdh1 in rcc and adjacent tissues. the expression of cdh1 in tissues was detected by competitive rtpcr.the data of 2 groups were compared and the correlation between clinical characteristics of rcc and the expression of cdh1 was analyzed.results the expression of cdh1 (4.3±1.8) ng/ml in patients with rcc was significantly lower than that (6.8±3.1) ng/ml of patients without tumor (p<0.05). the positive rate of cdh1 expression in rcc patients was 36.1% (13/36),which in cancer adjacent tissue was 69.4% (25/36),there was a significant difference in the expression of cdh1 between rcc group and control group (p<0.05).there was a significant difference in total rna and mrna levels of cdh1 between rcc tissues and cancer adjacent tissues (p<0.05).conclusion the downregulation of cdh1 gene expression may play an important role in the incidence of rcc.
【key words】 renal cell carcinoma;cdh1;gene
e钙粘连素(ecadherin,cdh1)是一种细胞粘连分子，对细胞间的联接和相互作用具有关键作用[1]。WWw.11665.COM我们采用体外实验方法分析肾细胞癌(rcc)与癌旁组织中cdh1表达的关系,初步探讨cdh1表达与肾透明细胞癌发病的关系，报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择我院2007年1月至2008年1月rcc患者36例的血液、rcc肿瘤组织及癌旁组织标本为rcc组。其中男24例，女12例;年龄40～75岁，平均年龄61岁。对照组36例，其中男30例，女6例;年龄45～71岁,平均年龄63岁。均为非肿瘤患者，其中泌尿系结石11例，损伤17例，非特异性感染8例，取血液标本。血液标本-20℃保存，术后新鲜肾组织中分别留取癌灶组织、癌周组织各约200 mg,迅速置于-85℃保存，供免疫组织化学、总rna制备和cdh1基因扩增用。肿瘤组均经病理检查确定临床分期和病理分级。
1.2 血液标本中cdh1检测 elisa方法测定：取血2～3 ml，离心15 min，8 000 r/min，取血浆保存在-70℃冰箱。同时，在去rnase处理后的净化台肾癌组织和癌周组织各1 mg，加入1 ml冰磷酸盐缓冲液(pbs)，电动匀浆后，4℃离心(1 500 r/min)10 min，取上清液500 μl。采用自晶美公司双抗夹心elisa方法测定外周血浆和组织的cdh1浓度。
1.3 组织cdh1表达检测 采用免疫组化sp法：一抗为鼠抗人上皮性钙粘连素单克隆抗体(北京中山生物技术公司)，二抗为生物素标记的羊抗鼠igg，三抗为链霉亲和素一过氧化物酶混合液。结果判定：以细胞膜出现连续棕黄色颗粒为阳性细胞：(1)正常表达(+)：切片内阳性细胞数≥90%;(2)降低表达(-)：切片内阳性细胞数<90%。
1.4 组织cdh1表达检测 (1)组织总rna制备： 精确称取肾癌组织和癌周组织，置于经depc水处理的无核糖核酸酶的匀浆器中，立即加入trizol抽提试剂，按操作步骤进行总rna的制备，按快速抽提法制备总rna。在紫外/可见分光光度计(beckman64)测a260及a280吸收比值确定rna浓度。一步法rtpcr试剂盒由美国promega提供。换算出肾组织中总rna浓度(μg/mg组织)。(2)cdh1cdna合成： cdh1cdna合成，取组织中总rna 2 μg，加入随机引物和逆转录酶于23℃10 min;42℃ 60 min;95℃10 min反应合成cdh1cdna，置-20℃保存备用。总rna纯度采用变性胶电泳鉴定。(3)cdh1竞争性pcr方法半定量分析： 按文献cdh1序列自行设计引物，扩增片段位于基因可编码区氨基侧。cdh1上游引物序列为:5'agagaacgcattgccacata3' (exon5);下游引物序列为：5'ccagggtatacgtagggaaac3'(exon 8)。扩增片段长度为367 bp。外周血单核细胞中rna 2 μg，第1阶段pcr以外部引物和cdna，在dna扩增仪上以程序为94℃，25 s;55℃，30 s;72℃，90 s循环30次，其扩增产物为312 bp，第2阶段pcr以第1次产物为模板和内部引物，反应循环程序同上。扩增最终pcr产物为159 bp。扩增产物经琼脂糖电泳，在紫外光照射下与dna标准物质进行比较，判别外周血中cdh1mrna的扩增结果。
1.5 统计学分析 应用spss 11.5 统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血液标本中cdh1检测结果 rcc组cdh1(3.5～5.2)ng/ml，平均(4.3±1.8)ng/ml;对照组cdh1(4.5～9.6)ng/ml，平均(6.8±3.1)ng/ml，2组比较差异有统计学意义(p<0.05)。
2.2 组织cdh1表达结果 肾癌组织中cdh1表达阳性率为36.1%(13/36)，癌旁组织中的表达阳性率为69.4%(25/36)，肾癌组织与癌旁中cdh1表达阳性率比较差异有统计学意义(p<0.05)。
2.3 组织cdh1rna表达结果 在自身配对的肾癌和癌周组织中,总rna浓度在组间存在着明显差别，癌组织cdh1明显低于癌周组织。以pcr扩增组织中cdh1mrna片段，癌灶组织cdh1mrna阳性44.5%(16/36)，明显低于癌周组织83.3%(30/36)(p<0.05)。
3 讨论
cdh1是原型钙粘素家族成员，定位于16q22表达产物主要分布在人和动物的上皮组织，对维护上皮细胞的形态和结构完整起着重要作用。在人体许多组织均有表达，尤其在膀胱和前列腺肿瘤组织中表达丰富。是一种依赖于钙离子的细胞间粘附分子，对于细胞间的联接和相互作用具有关键作用。cdh1表达水平下调或缺失，细胞粘附力即下降，使肿瘤细胞易分散而向外周呈浸润性生长，一旦获得转移的条件，即可脱离原发灶而发生转移[2]。目前，国内外对cdh1的研究较多，认为cdh1作为一种重要的肿瘤抑制因子为研究肿瘤转移机制的研究提供新的信息，许多上皮来源的恶性肿瘤如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌等中均有cdh1表达缺失，其肿瘤的病理分级、浸润性生长、淋巴结转移和远处转移均与cdh1表达下调有关[1,3,4]。
本组结果显示rcc组患者血浆中cdh1水平较对照组低(p<0.05)。肾癌组织中cdh1表达阳性率为36.1%(13/36)，癌旁组织中的表达阳性率为69.4%(25/36)，肾癌组织与癌旁中cdh1表达比较差异均有统计学意义(p<0.05)，肾癌组织cdh1总rna和mrna水平与癌旁组织比较差异有统计学意义(p<0.05)，提示cdh1的表达下调对肾癌发生有显著影响。推测cdh1基因可能是肾癌的抑制基因，其表达下调在肾癌发病机制中可能发挥重要作用。migita等[5]认为cdh1基因可能通过p27基因下调及激活egfr，刺激细胞增殖而在人类肿瘤的发生中起作用。cdh1作为抑癌基因的作用不同程度的丧失，导致细胞间联接松散和肾脏肿瘤易于从原发灶脱落，发生浸润和远处转移,导致肿瘤侵袭能力提高。
shimazui等[6]在肾癌细胞系中的研究发现，cdh1和钙粘连素6在细胞粘附中起作用，而n钙粘连素可能在细胞间粘附中起到不同的作用。nojima等[7]用rtpcr法检测了34例肾细胞癌显微切割标本及5株肾癌细胞系，发现34例中的23例患者cdh1表达较正常组织减少，相应的cdh1基因启动子甲基化增多。5株肾癌细胞系均发现cdh1基因启动子甲基化，并出现cdh1基因及蛋白表达缺失。在用去甲基化药物处理后，肾癌细胞系重新恢复表达ecadherin，该结果提示cdh1基因异常甲基化对肾癌发生有促进作用。
cdh1表达下调机制目前尚不清楚，可能是转录水平的下降，膀胱肿瘤组织cdh1表达下调与cdh1mrna表达下调一致[8]。李龙承等[9]检测前列腺癌细胞株cdh1基因的甲基化状态发现cdh1表达的缺失、cdh1和cdh1 mrna表达下调与cdh1基因启动子5′cpg位点甲基化有关，用去甲基化剂azac治疗cdh1表达阴性细胞株能恢复cdh1表达。cdh1 mrna表达下调可能与cdh1基因的snp有关。shin等[10]在偶发性胃癌中研究了cdh1基因启动子347处存在的snp与转录调控的关系，结果显示ga基因型与gg基因型对e钙粘连素的转录具有统计学意义，他们推测可能是gg基因型减弱了转录因子的粘附作用，从而降低了cdh1基因的转录活性。
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9 李龙承，张旭，陈忠，等.e钙粘连素基因启动子甲基化与该基因表达及前列腺癌病理分级的关系.中华实验外科杂志，2000，17:431432.
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