作者：张东生 丁娅 李苏 黄慧强 夏忠军 李志铭 林旭滨 姜文
【摘要】 【目的】 检测cd22抗原在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中的表达，初步探讨cd22抗原在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织的表达和临床病理特征的关系。【方法】 采用免疫组化方法检测b细胞非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织cd22抗原的表达，分析肿瘤组织cd22抗原表达和临床病理特征等的关系。【结果】 cd22抗原在b细胞非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织阳性表达主要见于细胞浆和细胞膜。全组21例，阳性率100.00%(21/21)，强阳性(+++)率14.29%(3/21)，中等阳性(++)率33.33%(7/21)，弱阳性率(+)52.38%(11/21)。cd22表达与病理亚型、性别、年龄以及其它临床病理特征等无明显相关性。【结论】 cd22抗原在b细胞非霍奇金淋巴瘤中广泛表达，可以采用免疫组化的方法检测出，该方法简单易行，有一定临床应用前景;b细胞非霍奇金淋巴瘤组织cd22表达和临床病理特征的关系需进一步研究。
【关键词】 非霍奇金淋巴瘤; cd22抗原; 免疫组化
abstract： 【objective】 to examine the cd22 antigen expression in b cell non-hodgkin's lymphoma (nhl) tissues and investigate its relationship with clinicopathological characteristics. 【methods】 cd22 antigen expression in b cell nhl tissues was detected with immunohistochemistry staining. the correlation between cd22 expression and clinicopathological characteristics was analyzed. 【results】 cd22 antigen was detected in b cell nhl tissue section by immunohistochemistry staining. the positive staining particles were located in cytoplasma and/or membrane. cd22 expression was showed in the total 21 cases (positive rate 100.00%). strong expression in 3 cases (14.29%)， moderate expression in 7 cases (33.33%)， and weak expression was detected in 11 cases (52.38%). cd22 expression in b cell nhl tissue was not correlated with pathologic subtypes， gender， age， or other clinicopathological characteristics. 【conclusion】 cd22 antigen is generally expressed in b cell nhl and easily detected by immunohistochemistry staining， and the detection method can be used in clinical practice. cd22 expression in b cell nhl tissue and its relationship with clinicopathological characteristics needs further study.
抗原分子是一个相对分子质量为135 k的跨膜蛋白，为b淋巴细胞限制性抗原。WWw.11665.COM在b细胞和前b细胞，cd22抗原仅存在于胞浆中，分化至成熟b细胞时，该抗原表达在细胞膜上，激活时表达量增加。b细胞分化至终末阶段浆细胞时，cd22抗原消失。cd22为粘附分子，可以放大b细胞激活信号。cd22广泛表达于正常b细胞和b细胞淋巴瘤细胞[1-2]。cd22作为b细胞非霍奇金淋巴瘤治疗的新靶点，是目前研究的热点和焦点，已取得较大的进展[1-7]。目前国内外均有针对cd22靶点的新药在进行临床试验，国外的ⅰ/ⅱ期研究结果以及国内本课题组完成的ⅰ期临床研究结果，均令人较为鼓舞，有进一步研究的前景[1-6]。因此，找到简单、临床使用方便的检测cd22抗原的方法，不仅具有理论意义，更具有实际的临床应用前景。目前检测cd22表达抗原表达常用流式细胞仪检测的方法[8-9]，但流式细胞仪只能检测新鲜肿瘤组织或细胞株中cd22抗原表达，临床应用较为不便。我们在国内首次采用免疫组化的方法检测21例非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织cd22抗原表达，效果确实，方法简便可行，并初步探讨cd22表达水平和临床病例特征的关系。
1 材料和方法
1.1 实验标本
21例b细胞非霍奇金淋巴瘤患者肿瘤组织石蜡块中，12例取自中山大学肿瘤防治中心病理科，均为存档石蜡组织块，9例取自外院病理科，由患者借出。将组织蜡块切成4 μm厚的切片粘在涂胶玻片上备用。
1.2 患者资料
患者为自2007年4月至2008年11月来中山大学肿瘤医院就诊，共21例b细胞非霍奇金淋巴瘤患者。21例患者中，男10例，女11例，年龄范围24 ～ 67岁，中位年龄52岁，体力情况0 ～ 2级。21例患者的病理亚型，滤泡性淋巴瘤8例，滤泡转弥漫2例，弥漫大b细胞淋巴瘤8例，小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白细胞(sll/cll)2例，伯基特淋巴瘤1例;19例为复治患者，2例为初治患者，均为滤泡性淋巴瘤;复治患者既往使用过cd20单抗治疗，或一种或多种方案化疗，部分患者接受过放射治疗。8例患者既往使用过美罗华或国产cd20单抗，1例移植后复发，1例既往使用过zevalin。
1.3 实验主要试剂和步骤
抗cd22抗体购自武汉博士德生物工程有限公司(进口分装)，为1只0.2 ml 兔抗人igg多抗。s-p超广谱免疫组化试剂盒(含阻断血清、二抗与三抗)及dab购自迈新公司。免疫组化步骤按照迈新公司推荐的s-p法免疫组化实验步骤进行。切片放入二甲苯梯度稀释液中脱蜡，无水乙醇梯度至水，新鲜配置3%过氧化氢，室温10 min灭活内源性过氧化物酶，pbs微波修复抗原，滴加血清封闭以减少非特异性染色，滴加1：100稀释的cd22兔抗人多抗，4 ℃反应过夜，滴加生物素化二抗igg 37 ℃反应30 min，dab显色，苏木素轻度复染30 s左右，盐酸分化，二甲苯透明，用中性树胶封片。
1.4 免疫组化结果判断
对照he切片，确定肿瘤细胞区域。以肿瘤细胞胞浆或胞膜见到棕黄色或棕褐色颗粒染色为阳性细胞，连续数10个高倍镜视野中的肿瘤细胞数，10个视野中阳性肿瘤细胞数之和除以10个视野中肿瘤细胞数之和即为肿瘤细胞染色的百分比，根据肿瘤细胞染色的百分比划分为不同的等级：(-)或阴性为阳性细胞0;(+)或弱阳性为阳性细胞比例≤25%;(++)或中等阳性为阳性细胞比例达 > 25% ～ < 50%;(+++)或强阳性为阳性细胞比例≥50%。(-)和(+)为低表达，(++)和(+++)为高表达。
1.6 统计学方法
采用spss 16.0统计软件进行统计分析，频数资料采用fisher精确概率法以及非参数的kruskal-wallis h检验，以p < 0.05定义为有统计学意义。
2 结 果
2.1 cd22抗原在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中的表达
cd22抗原可以采用免疫组化方法在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中检测出，阳性表达的棕黄色或棕褐色颗粒主要见于细胞浆和细胞膜。全组21例，阴性0例，弱阳性(+)11例，中等阳性(++) 7例，强阳性(+++)3例，高表达10例，低表达11例，阳性率100.00%(21/21)，中等阳性率33.33%(7/21)，强阳性率14.29%(3/21)。cd22抗原在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中的弱阳性、中等阳性、强阳性以及阴性表达分别见图1a ～ d。
2.2 cd22抗原在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中的表达和临床病理特征的关系
全组8例弥漫大b细胞淋巴瘤患者，肿瘤组织中cd22抗原呈弱阳性表达2例，中等阳性表达4例，强阳性表达2例;8例滤泡性淋巴瘤患者，弱阳性表达7例，中等阳性表达1例;2例滤泡转弥漫的非霍奇金淋巴瘤患者，1例为中等阳性的表达，1例为强阳性表达，2例慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤患者，肿瘤组织cd22表达均为弱阳性。1例伯基特淋巴瘤患者，肿瘤组织cd22抗原呈中等阳性表达。非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织cd22表达与病理亚型、性别、年龄以及其它临床病理特征无明显相关性(表1)。
3 讨 论
cd22是b细胞非霍奇金淋巴瘤细胞表面重要的标记性抗原之一，针对cd22分子靶点的研究，越来越深入。目前已有研究出针对b细胞非霍奇金淋巴瘤cd22抗原分子靶点药物：国外的人缘化单抗epratuzumab(依帕珠单抗)，国内的人鼠嵌合单克隆抗体sm03。前者已完成ⅰ/ⅱ期临床研究，并正在进行ⅲ期临床研究，后者在中山大学肿瘤防治中心本课题组已完成ⅰ期临床研究(论文待发表)。可以预见cd22抗体在不久的将来，很有可能广泛用于临床治疗b细胞非霍奇金淋巴瘤。因此如何找到临床实用方便检查和筛选cd22靶点的方法就摆在我们面前。
cd22抗原的检测方法常用流式细胞仪检测[8-9]，但流式细胞只能检测新鲜肿瘤组织中或细胞株中的cd22抗原表达，对于在石蜡组织，流式细胞仪不能检测出。
用免疫组化的方法检测石蜡组织中cd22的表达，检测方法简单、实用，临床使用方便[10-11]。我们采用免疫组化的方法，检测了21例非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织患者肿瘤石蜡组织中cd22的表达，结果表明：cd22抗原可以采用免疫组化方法在非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织中检测出，阳性表达的棕黄色或棕褐色颗粒主要定位于细胞浆和细胞膜。全组21例，阴性0例，弱阳性(+)11例，中等阳性(++)7例，强阳性(+++)3例，高表达10例，低表达11例，阳性率100.00%(21/21)，中等阳性率33.33%(7/21)，强阳性率14.29%(3/21);8例弥漫大b细胞淋巴瘤患者，肿瘤组织中cd22抗原呈弱阳性表达2例，中等阳性表达4例，强阳性表达2例;8例滤泡性淋巴瘤患者，弱阳性表达7例，中等阳性表达1例;2例滤泡转弥漫的非霍奇金淋巴瘤患者，1例为中等阳性的表达，1例为强阳性表达，2例慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤患者，肿瘤组织cd22表达均为弱阳性。1例伯基特淋巴瘤患者，肿瘤组织cd22抗原呈中等阳性表达。
文献报道b细胞非霍奇金淋巴瘤cd22抗原表达率非常高，约80%左右，也有100%表达的报道[1-2，11]。cd22肿瘤组织抗原表达可以采用免疫组化方法检测出。采用免疫组化的方法检测b细胞非霍奇金淋巴瘤肿瘤组中cd22抗原的表达，国内未见报道，国外报道较少。我们在国内首次采用免疫组化的方法，检测到b细胞非霍奇金淋巴瘤肿瘤组织cd22抗原的表达，效果确实，方法简便可行。我们研究表明，cd22阳性表达率100%，表达率高，可能是我们采用的判断标准较为较宽。我们的研究判断标准中，定义10个视野中未见到cd22染色阳性的肿瘤细胞才认为是阴性表达。
cd22抗原表达和临床和病理特征的关系，国外很少有报道。由于我们研究的病例数较少，没有观察到cd22表达和临床病理特征的相关性，但我们也注意到，弥漫大b细胞淋巴瘤患者肿瘤组织cd22抗原表达较强，滤泡型淋巴瘤肿瘤组织中cd22抗原表达较弱，cd22抗原表达和临床和病理特征的关系有待进一步研究。
【参考文献】
leonard jp， coleman m， ketas jc， et al. epratuzumab， a humanized anti-cd22 antibody， in aggressive non-hodgkin's lymphoma： phase ⅰ/ⅱ clinical trial results[j]. clin cancer res， 2004， 10(16)： 5327-5334.
leonard jp， coleman m， ketas jc， et al. phase ⅰ/ⅱ trial of epratuzumab (humanized anti-cd22 antibody) in indolent non-hodgkin's lymphoma [j]. j clin oncol， 2003， 21(16)： 3051-3059.
micallef in， maurer mj， nikcevich， da， et al. a phase ii study of epratuzumab and rituximab in combination with cyclophosphamide， doxorubicin， vincristine and prednisone chemotherapy (er-chop) in patients with previously untreated diffuse large b-cell lymphoma [j]. j clin oncol， 2008， (may 20 suppl; abstr 8500).
strauss sj， morschhauser f， rech j， et al. multicenter phase ii trial of immunotherapy with the humanized anti-cd22 antibody， epratuzumab， in combination with rituximab， in refractory or recurrent non-hodgkin's lymphoma [j]. j clin oncol， 2006， 24(24)： 3880-3886.
leonard jp， goldenberg dm. preclinical and clinical evaluation of epratuzumab (anti-cd22 igg) in b-cell malignancies [j]. oncogene， 2007， 26(25)： 3704-3713.
carnahan j， stein r， qu z， et al. epratuzumab， a cd22-targeting recombinant humanized antibody with a different mode of action from rituximab [j]. mol immunol， 2007， 44(6)： 1331-1341.
hansen jk， weldon je， xiang l， et al. a recombinant immunotoxin targeting cd22 with low immunogenicity， low nonspecific toxicity， and high antitumor activity in mice [j]. j immunother， 2010， 33(3)： 297-304.
huang j， fan g， zhong y， et al. diagnostic usefulness of aberrant cd22 expression in differentiating neoplastic cells of b-cell chronic lymphoproliferative disorders from admixed benign b cells in four-color multiparameter flow cytometry [j]. am j clin pathol， 2005， 123(6)： 826-832.
olejniczak sh， stewart cc， donohue k， et al. a quantitative exploration of surface antigen expression in common b-cell malignancies using flow cytometry[j]. immunol invest， 2006， 35(1)： 93-114.
lindén o， hindorf c， cavallin-st?覽hl e， et al. dose-fractionated radioimmunotherapy in non-hodgkin's lymphoma using dota-conjugated， 90y-radiolabeled， humanized anti-cd22 monoclonal antibody， epratu-zumab [j]. clin cancer res， 2005， 11(14)： 5215-5222.
perkins sl， lones ma， davenport v， et al. b-cell non-hodgkin's lymphoma in children and adolescents： surface antigen expression and clinical implications for future targeted bioimmune therapy： a children's cancer group report [j]. clin adv hematol oncol， 2003， 1(5)： 314-317.
