【摘要】 目的：观察不同脑缺血再灌注动物模型的脑损伤程度，探讨不同脑缺血再灌注模型的应用。方法：制备双侧颈总动脉阻断再灌模型(bcco)、线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型(mcao)、四血管法全脑缺血再灌模型(gi)，采用海马ca1区map2免疫组织化学染色观察其脑损伤情况，morris水迷宫评价其行为学。结果：map2免疫表达显示gi组脑损伤最严重，ca1区细胞数量最少，map2表达最低，而bcco组脑损伤最轻，ca1区细胞数量无明显减少，map2表达仅略有降低。行为学研究表明，mcao和gi组行为学明显改变。结论：不同的脑缺血模型的应用不同，bcco模型可用于轻微缺血的预防，mcao模型适用于局部损伤后脑功能改变及治疗药物评价，gi是研究缺血损伤后恢复相对理想的模型。
【关键词】 脑缺血;脑损伤;动物模型;大鼠
[abstract] objective: to investigate the application of three kinds of cerebral ischemiareperfusion animal model according to the degree of injury. methods:the bilateral common carotid artery occlusion(bcco), cerebral middle cerebral artery occlusion (mcao) by stringfastening method, global ischemia(gi) by fourartery occlusion were used to establish cerebral ischemiareperfusion animal model. the degree of brain injury was evaluated through the expression of map2 in hippocampal ca1 region and the morris water maze. results: the result of the expression of map2 indicated the injury of gi group was the most severe, and the damage of bcco group was the most mild.compared with the normal group,the behavior change of reperfusion was the significant in the mcao and gi groups. conclusion:the three animal models should be applied in different researches. the bcco model could be used in prevention of mild ischemia. the mcao model could be used in the change of cerebral function and the drug evaluation. the gi model could be used in recovery after cerebral ischemia.
[key words] cerebral ischemia; cerebral injury; animal ; rat
脑血管疾病是世界上严重危害人类健康的三大疾病之一, 发病率已达到104. 53/10万。Www.11665.COM缺血性脑血管疾病( icvd ) 发病率有逐年增高趋势, 死亡率可达56. 6%～80% , 即使存活, 也留有严重的后遗症影响生活质量。因此, 建立合适的动物脑缺血及缺血再灌注模型来模拟人类脑血管疾病并对之进行研究, 是深入研究其病变发生、发展和预后的基础，也是当前神经科学的热门课题之一。
大鼠具有脑血管解剖结构和功能与人类相近似、品种品系相对标准、良好的种内纯合性等特点，目前大多利用大鼠建立脑缺血再灌模型，但是对各种模型的制作效果未见文献报道。本文采用双侧颈总动脉阻断再灌模型(bcco)、线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型(mcao)、四血管法全脑缺血再灌模型(gi)等3种常用的局灶性脑缺血再灌动物模型，观察不同脑损伤情况下的形态学改变，并评价其行为学，旨在探讨不同模型的适应性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性wistar大鼠，6月龄，体重(200±50) g，经morris水迷宫筛选后，分为正常对照组(normal)，双侧颈总动脉结扎20 min再灌注组(bcco)，线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型组(mcao)，四血管法全脑缺血再灌模型组(gi)，每组6只。
1.2 morris水迷宫测试
morris水迷宫测试程序采用定位航行试验：每天4次，共3 d，均在10:00am～5:00pm之间完成。将大鼠头朝池壁轻轻放入水中，计时动物自入水至找到平台时间为潜伏期，同时观察搜索站台的轨迹。记录大鼠后8次测试的潜伏期，以平均潜伏期的90%区间作为筛选学习记忆功能正常大鼠的标准。
1.3 动物模型制备
bcco模型：大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 ml/100 g)麻醉，颈正中切口逐层切开皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露颈总动脉(common carotidartery， cca)，颈内动脉(internal carotid artery， ica)和颈外动脉(external carotid artery，eca)，分离双侧颈总动脉约1 cm，用动脉夹夹闭20 min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做morris水迷宫测试。
mcao模型：参照longa等[1]和罗勇等[2]报道的方法,采用经颈内动脉线栓法制备大鼠右侧mcao致局灶性永久性脑缺血模型。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 ml/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露右侧cca、ica和eca，探查eca在颈部发出第1分支(甲状颈干)处，在其远心端约0.2 cm处结扎并切断eca，确保eca残端长度不少于0.5 cm;结扎并切断eca与ica之间的交通支。用动脉夹暂时阻断cca及ica血流，用眼科剪于eca 残端作一纵行小切口，用直径约0.2 mm的尼龙线，烧灼头端使其成为直径约为0.25 mm的线栓，将线栓从右侧eca残端插入ica;轻轻牵拉eca残端，使其与ica成一条直线，调整线栓角度，使线栓弧度水平向外，与颈前正中线呈45度水平向外的夹角，移去夹闭ica的动脉夹，轻轻将线栓送入颅内。从cca分叉处送入ica约1.9～2.1 cm时通常可遇阻力，大鼠呼吸、心跳突然加快，部分大鼠尿失禁，据此作为大脑中动脉起始处栓塞成功的标志。栓塞成功后，用丝线结扎eca残端，移去夹闭cca的蛙心夹，观察无活动性出血后关闭切口。缺血20 min后，将栓线抽至颈内动脉起始部恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做morris水迷宫测试。
gi模型：参考pulsinelli方法，采用改良的四血管夹闭方法制备四血管阻塞全脑缺血模型[3，4]。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 ml/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露cca和与之伴行的神经,钝性分离出cca，用棉线环cca成1cm的线环。两侧线环相互交叉埋于皮下，缝合切口。大鼠转移到立体定位仪上, 俯卧。头向下倾斜30 度固定。剪去头颈部的毛, 消毒。在枕骨下沿背正中切口,分离肌肉, 找到第1颈椎后弓上的横突孔, 用电凝针插入2～3 mm，灼断孔中的椎动脉, 使之永久性阻塞。电凝完毕, 缝合切口，大鼠放回饲养笼中, 让其自然苏醒, 禁食过夜, 自由饮水。以上手术24 h 后, 大鼠在清醒状态下仰卧固定, 重新打开颈部切口, 用动脉夹夹闭双侧颈总动脉, 使大鼠脑部供血完全阻断, 大鼠挣扎数秒后于30～60 s 内昏迷, 解除固定, 可见大鼠四肢上举, 翻正反射消失, 痛觉反应消失, 双侧瞳孔散大, 眼球呈灰白色, 身体可呈角弓反张。缺血20 min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做morris水迷宫测试。
1.4 组织制备
用2%戊巴比妥钠(0.12 ml/50 g体重)腹腔注射麻醉后，迅速开胸暴露心脏，灌注固定后取脑，后固定2～4 h后，分别置于15%和30%蔗糖梯度溶液中直至标本沉底。冰冻切片机作连续冠状切片，取海马和齿状回互包平面，片厚30μm，用小鼠抗map2单克隆抗体作abc免疫组织化学染色，用正常羊血清代替一抗作阴性对照。
1.5 统计学处理
用hpias高清晰度彩色病理图像测量系统测定海马ca1区神经元胞浆map2反应产物的od值，并减去同一张切片的背底od值，即矫正的od值(cod值)，每例标本检测3张切片，每张切片检测3个视野。实验数据用spss 13.0统计软件分析，采用单因素方差分析比较样本均数。
2 结果
2.1 水迷宫检测
正常大鼠定位航行试验潜伏期稳定，在5 s左右可找到平台。bcco组大鼠搜索策略以直线式搜索策略为主，其潜伏期与正常组比较略有增加，且波动较大，但是无统计学意义(p >0.05)。mcao组和gi组均有潜伏期增加，与正常对照组有统计学意义(p<0.01)，其搜索策略转变为边缘式和随机式为主。见表1。表1 各组动物morris水迷宫潜伏期注：各组比较f=81.798，p<0.01; *与normal组比较p<0.01。
2.2 海马map2免疫组织化学染色
正常组海马ca1区map2主要在神经元树突表达，突起平滑而且完整(图1a);而核周质弱表达。bcco组可观察到海马ca1区神经元树突map2的表达增加，突起断裂不完整，粗细不一致(图1b);gi组突起表达更加紊乱，可观察到螺旋样变(图1c);mcao组突起表达有断裂，不完整(图1d)。统计分析表明，map2表达cod值在各组之间差异有显著性(f=354.906，p<0.01)，见表2。表2 大鼠海马ca3区map2免疫染色cod值注：*与normal组比较 p<0.01。
3 讨论
缺血性脑血管病的实验动物模型是研究缺血性脑损伤和脑保护必不可少的工具，有关大鼠局灶性脑缺血再灌注模型已建立多种方法。de reuck等[5]的研究提示，脑血管储备功能的下降导致全脑代谢储备消耗是血管性痴呆发生的可能机制;动物空间记忆能力下降，是由于血管结扎导致局部脑血流下降而影响与学习记忆有关的结构。孙莉等[6]采用双侧颈总动脉结扎模型发现，结扎导致实验动物水迷宫测试成绩下降，并且这种下降随结扎天数的延长而加大。赵宪林等[7]用这种方法结扎时间长达4月，结果发现30只结扎鼠中有25只痴呆鼠，呈轻、中度痴呆分别是9只、13只。本实验也表明，在双侧颈总动脉结扎再灌后，形态学和行为学方面有所改变。
大鼠全脑缺血再灌注模型，它的解剖学基础在于大鼠腹侧的脊髓动脉有一定向脑干的返支，四血管闭塞期间可以维持脑干的血液供应，使得大鼠在一定时间内能够存活下来。由于全脑缺血对大鼠的脑组织损伤严重，而再灌注，不仅没有使损伤的脑组织得以恢复，反而由于细胞内ca2+超载、一氧化氮以及氧自由基等作用使损伤程度进一步加深[8]。本实验也证实全脑缺血后引起脑形态学和学习记忆能力的严重损伤，是研究血管性痴呆的良好模型。
大鼠中动脉(mca)阻塞为临床上缺血性脑血管病的多发部位，故mca阻断模型被广泛应用于脑梗塞的研究。其中，血管内直接插线闭塞法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型具有不开颅、损伤小、操作简便、不需特殊设备、缺血区部位较恒定、可准确控制缺血和再灌注时间、易控制局部条件、全身影响小等优点，被广泛用于脑缺血/再灌注的研究中。目前对该模型有较多的研究,刘亢丁等[9]认为该模型大鼠体重应控制在250～300 g ;马常升等[10]发现,当大鼠体重为190～239 g 时,宜选择插线的直径为0.185 mm ,体重为239～300 g 时,插线直径宜为0.200 mm;徐佳等[11]研究模型栓线插入的深度认为,要得到成动的模型栓线插入深度最少要达到1. 65 cm。与全脑缺血模型相比, mcao模型可形成特定部位的脑梗死并进行再灌注, 对全身影响较小, 与人脑梗死的发病情况更相似, 所以目前应用更为广泛。其中, 栓线法因其缺血部位恒定、能准确控制缺血后再灌注时间等优点, 适用于脑缺血及再灌注多方面的研究。
通过对各组再灌后的行为学检测，分析发现3组之间行为学有明显区别，对于在行为学的基础上结合map2染色来评价脑缺血再灌注模型的脑损伤程度。观察发现，不同模型缺血坏死程度不同，结合行为学评分我们认为，不同的缺血再灌模型的应用范围应有所侧重，不同的脑缺血模型的应用不同，双侧缺血模型可用于轻微缺血的预防，线栓法应用于局部损伤后脑功能改变及治疗药物评价，全脑缺血再灌注动物模型是研究缺血损伤后恢复相对理想的模型，对于慢性脑缺血、脑缺血的药物及一些特殊领域的研究具有较高的价值。
各种脑缺血动物模型的制备方法各有优缺点，研究者应根据实验目的及研究方向做出相应的选择。目前, 脑缺血动物模型的研究在制备方法、实验条件的控制等方面都取得了很大进展, 而且转基因小鼠的出现, 超声、mr、mra、介入等新技术的发展及其在模型制备中的应用, 在很大程度上促进了脑缺血模型的研究。但还有很多问题尚待解决, 如怎样更好地控制脑梗死灶的部位和范围, 更准确地控制缺血和再灌注时间等。脑缺血动物模型的日趋完善, 将为人们更深刻认识icvd 发病机制, 研究新的治疗对策等提供更准确的信息。
【参考文献】
1 longa ez, weinstein pr, carlson s, et al. reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[j]. stroke, 1989, 20 (1): 84 91.
2 罗勇, 董为伟. wistar大鼠插线法局灶性脑缺血/再灌注模型的实验研究[j].重庆医科大学学报, 2002, 27 (1): 1 3.
3 pulsinelli wa, brierley jb. a new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[j]. stroke，1979，10(3): 267272.
4 gong l, gao tm, li x， et al. enhancement in activities of large conductance calciumactivated potassium channels in ca1 pyramidal neurons of rat hippocampus after transient forebrain ischemia[j]. brain res,3000，884(12): 147154.
5 de reuck j, decoo d, hasenbroekx mc， et al. acetazolamide vasoreactivity in vascular dementia: a positron emission tomographic study[j]. eur neurol，1999， 41(1): 3136.
6 孙莉，吴江，王守春，等.慢性前脑缺血大鼠学习、记忆功能的研究[j].中风与神经疾病杂志，2002,19(1):2022.
7 赵宪林，李东培，方秀斌,等.血管性痴呆大鼠海马神经元超微结构的研究[j].解剖科学进展，2000,6(2):161163.
8 张国瑾, 赵增荣. 国外脑血管疾病研究进展[m]. 北京: 中国医药科技出版社,2000.116 118.
9 刘亢丁,苏志强,李毅平,等. 实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改进及评价[j].中风与神经疾病杂志,1997,14(2):8789.
10 马常升,马文领,戴维国,等. 插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的研究[j]. 解剖学杂志,1999,22(3):209.
11 佳,葛林宝,徐明曙,等. 大鼠栓线法maco 模型中插入深度的研究[j].上海实验动物科学,2002,22 (4):209212.
