作者：王海彬,曾展鹏,谭彤燕,梁笃,杨冰,刘锋
【摘要】 【目的】研究成骨细胞分化过程中线粒体生成的变化。【方法】采用mitotracker green染色、流式细胞仪检测成骨细胞mg63分化过程中线粒体生成的变化；以细胞核基因组为内参,实时定量pcr检测细胞线粒体基因组数量和进一步检测细胞线粒体生成相关基因雌激素相关受体(errs)及其共激活因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子(pgc1s)表达的变化。【结果】成骨细胞分化过程中线粒体生成显著减少,线粒体基因组数量显著下降,细胞线粒体生成相关基因errs及其共激活因子pgc1s表达显著降低。【结论】成骨细胞mg63分化过程中线粒体生成显著降低。
【关键词】 成骨细胞；分化；线粒体生成；雌激素相关受体
abstract：objectiveto explore the mitochondrial biogenesis in osteoblast differentiation. methodsmitochondrial biogenesis in osteoblast differentiation was detected by mitotracker green staining and flow cytometric analysis. with nuclear genome as the internal standard, real time quantitative polymerase chain reaction (pcr) was applied to detect the number of mitochondrial genome. the expression of estrogenrelated receptors (errs) and their coactivators peroxisome proliferatoractivated receptorgamma coactivator1s (pgc1s) which play key roles in mitochondrial biogenesis was detected by real time quantitative pcr. resultsboth mitochondrial biogenesis and the number of mitochondrial genome decreased during osteoblast differentiation, and the results of real time quantitative pcr also showed that the expression of errs and pgc1s was downregulated. conclusionmitochondrial biogenesis in osteoblastlike mg63 differentiation is downregulated.
key words：osteoblast；differentiation；mitochondrial biogenesis；
线粒体为细胞的生命活动提供场所,是细胞内氧化磷酸化和形成atp的主要场所,有“细胞能量工厂”之称。wWW.11665.cOM线粒体功能和数量的变化被认为在细胞的增殖分化中起着重要作用。线粒体膜电位的变化和线粒体活性氧的产生直接影响到细胞的生存,因此线粒体被认为在细胞的增殖凋亡中起着关键作用［1-2］。除此之外,线粒体的数量和生成也被研究证实在细胞增殖分化中起着重要作用［3-5］。成骨细胞的长期培养被广泛用于成骨细胞的分化研究中［6-9］,但其分化过程中线粒体生成的变化尚无明确报道。本研究采用流式细胞仪检测和实时定量pcr检测方法,观察在分化过程中成骨细胞株mg63细胞线粒体生成相关基因雌激素相关受体（errs）及其过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子(pgc1s)表达的变化,现报道如下。
1材料与方法
1.1主要试剂及仪器成骨细胞株mg63购自美国典型培养物保藏中心,pt200型定量pcr仪为美国mj research公司产品，facs calibur流式细胞仪为美国bd biosciences公司产品，二氧化碳培养箱购自德国heraeus公司。 dmem培养液、胎牛血清、青链霉素、2.5 g/l 胰蛋白酶—乙二胺四乙酸二钠(trypsinedta)均购自hyclone公司,trizol、逆转录试剂盒和mitotracker green染料均购自invitrogen公司,定量pcr试剂盒购自大连宝生物公司,基因组提取试剂盒购自promega公司,其他各种化学试剂均为sigma公司产品或国产化学分析纯。
1.2细胞培养成骨细胞株mg63培养于含体积分数10%胎牛血清及抗生素(100 u/ml青霉素、100 g/ml链霉素)的dmem培养液中,在37℃、体积分数5%的co2培养箱湿润培养。将成骨细胞培养至融合状态设定为分化的第0天,之后继续培养3、7、14 d用于检测细胞线粒体生成和基因表达的变化。
1.3流式细胞仪检测细胞线粒体生成将分化0、3、7、14 d的成骨细胞mg63使用磷酸盐缓冲液（pbs）洗涤1次,加入含有10 μg/ml mitotracker green染料的无血清温浴培养基,37℃温育20 min,pbs洗涤2遍后,收集细胞约1×106个,pbs洗涤2遍,流式细胞仪检测,每个样本检测12 000个细胞,测定细胞的荧光强度值。以第0天为对照,设定其线粒体生成为100%,结果与第0天比较。
1.4实时定量pcr检测线粒体基因组数量将分化0、3、7、14 d的成骨细胞mg63,采用基因组提取试剂盒提取细胞总dna。以基因组dna βactin为内参,以线粒体dna(mtdna)及线粒体基因环氧化酶2(cox2)为靶标设计引物［10］,采用sybr premix ex taq试剂盒进行定量pcr检测线粒体基因组的变化。以第0天为对照,设定其线粒体基因数量为1,结果与第0天比较。引物序列为：cox2 f：5’cattattcctagaaccaggcgac3’；cox2 r:5’gaattaattctaggacgatgggc3’；mtdna f:5’caaacctacgccaaaatcca3’；mtdna r:5’gaaatgaatgagcctacaga3’；βactin f:5’ctcctcctgagcgcaagtactc3’；βactin r:5’tcctgcttgctgatccacatc3’。
1.5实时定量pcr检测errs和pgc1s的表达将分化0、3、7、14 d的成骨细胞mg63,使用trizol,并根据其提供的实验步骤提取总rna。再使用super script iii反转酶试剂盒反转2 μg总rna。以18s rrna为内参,采用sybr premix ex taq试剂盒进行定量pcr检测errs和pgc1s的基因表达。基因表达结果以第0天为对照,根据定量pcr计算公式2△△ct进行计算。引物序列为：18s rrna f:5’ggtgaaattcttggaccggc3’；18s rrna r:5’gactttggtttcccggaagc3’；pgc1α f:5’tcagtcctcactggtggaca3’；pgc1α r:5’tgcttcgtcgtcaaaaacag3’；pgc1β f:5’gctctcctccttcttcctca3’；pgc1β r:5’atagagcgtctccaccatcc3’。
1.6统计学方法实验结果采用spss 5.0统计软件进行分析。以平均值±标准差(±s)表示,结果采用卡方检验。
2结果
2.1成骨细胞株mg63细胞分化过程中线粒体生成的变化mitotracker green是当今最常用的检测细胞线粒体生成的染料。本研究采用mitotracker green染料染色和流式细胞仪检测技术检测成骨细胞mg63分化过程中线粒体生成的变化。图1结果显示：在mg63细胞分化过程中,线粒体生成显著减少。
2.2成骨细胞株mg63细胞分化过程中线粒体数量的变化既然成骨细胞mg63分化过程中线粒体生成显著减少,本研究进一步采用定量pcr法检测成骨细胞分化过程中线粒体基因组数量的变化。图2结果显示：在mg63细胞分化过程中线粒体基因组的数量显著下降。
2.3成骨细胞株mg63细胞分化过程中线粒体生成相关基因表达的变化既然成骨细胞分化过程中线粒体生成及其数量显著降低,本研究采用定量pcr检测errs及其pgc1s的表达。图3结果显示：errs和pgc1s的表达在成骨细胞mg63分化过程中显著降低,表明它们可能参与了成骨细胞分化过程中线粒体生成的调节。
3讨论
线粒体在细胞的能量代谢、信号转导、增殖、分化和凋亡中都起着关键作用［11］。雌激素相关受体(errs)属于核受体超家族,包括errα、errβ和errγ。errα协同其共激活因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α和1β(pgc1α和pgc1β)在细胞线粒体能量代谢和线粒体生成中具有重要的作用［12-13］。err参与和骨骼形成相关的雌激素受体(estrogen receptor,er)信号途径。和er类似,errα能够调节骨桥蛋白(osteopontin,opn)的表达,在成骨细胞分化阶段被合成,并且能够在大鼠颅顶细胞中控制骨形成,在成骨细胞中过量表达errα可以提高成骨细胞的分化和骨的形成,而用反义方法降低errα的合成可使大鼠的颅顶细胞的增殖明显受到抑制,从而抑制骨结节的形成［14］ 。但有关成骨细胞分化过程中线粒体生成及其雌激素相关受体表达的变化尚无研究。
研究采用mitotracker green染色和流式细胞仪检测发现,成骨细胞mg63分化过程中,细胞线粒体的生成显著降低。进一步采用定量pcr检测发现细胞线粒体基因组数量也显著降低,证实细胞线粒体生成的降低至少部分因为基因组的复制降低所致。erra和errg及其共激活因子pgc1s在细胞线粒体的生成中起着关键作用［15］,进一步采用定量pcr检测发现,这些基因的表达均显著降低,表明errs和pgc1s参与了成骨细胞分化过程中线粒体生成的变化,并进一步影响成骨细胞分化。综上所述，本研究初步阐明成骨细胞分化过程中线粒体生成的变化,为研究线粒体在成骨细胞分化过程中的作用提供了理论依据。
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