【摘要】 目的: 获得原核表达的可溶性大鼠ige依赖组胺释放因子（rhrf）, 并检测其诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能。方法: 克隆wistar大鼠rhrf基因完整编码区序列并在bl21细胞中进行原核表达, 纯化的可溶性重组rhrf刺激卵清蛋白变应原致敏的大鼠肺肥大细胞, 利用荧光分光光度法测定组胺释放量。结果: 测序证实克隆基因与genbank中大鼠ige依赖组胺释放因子（又称翻译控制肿瘤蛋白）mrna序列的一致性为97%, 推测的氨基酸序列一致性为95%。sdspage显示重组rhrf相对分子质量（mr）约为24000; 重组rhrf诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺不依赖变应原, 且呈剂量依赖关系。 结论: rhrf具有不依赖变应原诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能, 可能在ⅰ型超敏反应过程中发挥重要作用, 为进一步研究rhrf的免疫学功能打下基础。
【关键词】 大鼠 ige依赖组胺释放因子 基因克隆 原核表达 肥大细胞 组胺
[abstract] aim: to clone and express the gene encoding rat igedependent histaminereleasing factor (rhrf) and to study the effect of recombinant rhrf to induce histamine release from rat sensitized mast cells. methods: the complete coding region of rhrf was cloned and expressed in bl21 cells. the soluble recombinant rhrf was purified. aliquots of the mast cells obtained from the lungs of ovaimmunized rats were separately stimulated by recombinant rhrf at different concentration. the released histamine was measured by the opt spectrofluorometric procedure. results: the cloned dna fragment showed 97% nucleotide sequence identity and 95% deduced amino acid sequence identity with the mrna of rat igedependent histaminereleasing factor (or translationally controlled tumor protein) in genbank. the recombinant rhrf showed a mr of 24 000 in sdspage. the purified rhrf which was independent of the allergen induced histamine releasing from the sensitized mast cells in a dosedependent manner. conclusion: the recombinant rhrf, which showed the effect of inducing histamine release from sensitized mast cells, would play an important role in the allergen diseases.
[keywords]rat; igedependent histaminereleasing factor; gene cloning; prokaryotic expression; mast cell; histamine
组胺释放因子是一大类具有促进肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺等介质的生物活性物质的总称。wWw.11665.cOm根据发挥作用时对ige依赖与否, 可分为ige非依赖性和ige依赖性两类。1995年macdonald等[1]从人巨噬细胞系u937培养上清中鉴定出一种ige依赖组胺释放因子, 并证实其与人的翻译控制肿瘤蛋白（translationally controlled tumor protein, tctp）为同一蛋白, 与小鼠tctp氨基酸序列具有94%同源性。ige依赖组胺释放因子可促进嗜碱性粒细胞释放组胺、 il4、 il13[2]; 促进b细胞增殖和分泌免疫球蛋白[3]; 促进嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞释放il8[4, 5], 同时发挥嗜酸性粒细胞趋化因子作用[4], 引起局部炎症细胞聚集。因此认为该蛋白在ⅰ型变态反应过程中发挥重要调节作用。肥大细胞是ⅰ型超敏反应的关键效应细胞, 激活后释放组胺等多种介质。关于ige依赖组胺释放因子对肥大细胞的作用未见报道。本研究旨在获得大鼠ige依赖组胺释放因子（rat igedependent histaminereleasing factor, rhrf）重组蛋白, 观察其诱发大鼠致敏肥大细胞释放组胺的功能, 为以大鼠为模型进一步探讨ige依赖组胺释放因子在ⅰ型超敏反应发生过程中的作用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料 wistar大鼠购自中山大学实验动物中心; 原核表达载体pet30a及大肠杆菌菌株dh5α、 jm109、 bl21（de3）由本实验室保存; 核酸电泳mr标准、 蛋白质电泳mr标准、 限制性内切酶nde i和xho i、 t4 dna连接酶、 ex taq dna聚合酶、 dntp及pmd19t simple vector试剂盒购自大连宝生物工程有限公司; dna凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自北京赛百胜公司; trizol、 ⅰ型胶原酶为invitrogen公司产品; amv逆转录酶为promega公司产品; his·tag融合蛋白亲和纯化试剂盒为novegen公司产品; 卵清蛋白（ⅴ级）、 透明质酸酶、 组胺标准品为sigma公司产品; 氢氧化铝佐剂为武汉中博生化有限公司产品; 邻苯二甲醛（opt）为上海国药集团化学试剂有限公司产品; 引物设计由上海英骏生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 大鼠肝组织总rna的提取 无菌操作取大鼠肝组织, 总rna提取按照trizol试剂说明书步骤进行。
1.2.2 逆转录聚合酶链式反应 以大鼠肝组织总rna为模板进行逆转录, 反应体系20 μl, 反应条件为37℃ 45 min, 95℃变性5 min; pcr反应体系50 μl, 反应程序为95℃预变性5 min后, 开始以下循环: 95℃变性45 s, 54℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 共32个循环, 最后72℃延伸10 min。扩增产物经12 g/l琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 ta克隆 按照 pmd19t simple vector试剂盒说明书操作, 将rtpcr扩增产物纯化回收后与pmd19t simple vector连接, 转化大肠杆菌jm109, 在涂布有xgal和iptg、 且amp+的lb平板中挑取白色的阳性重组克隆, 经pcr、 双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司测序, 并与genbank中大鼠ige依赖组胺释放因子（又称tctp）mrna序列进行同源性分析。上游引物: 5′gaa cat atg atc atc tac cgg gac3′, 下游引物: 5′gcg ctc gag aca ttt ttc cat ct3′, 分别带有nde i和xho i酶切位点。
1.2.4 表达载体的构建 将以重组pmd19t simple vector为模板进行pcr得到的扩增产物和空载体pet30a用限制性内切酶nde i、 xho i进行双酶切, 纯化回收后连接, 转化大肠杆菌dh5α, 挑取阳性克隆扩增后提取重组质粒进行pcr、 双酶切和测序鉴定。
1.2.5 重组蛋白的表达 将重组质粒pet30arhrf转化bl21（de3）, 挑取阳性克隆接种于含卡那霉素(kan, 50 mg/l)的lb液体培养液中, 37℃振荡培养过夜, 再按1%转接至新鲜lb液体培养基中（kan+）, 37℃振荡培养2 h, 加入iptg至终浓度为1 mmol/l, 诱导表达5 h, 4℃离心收集菌体, 冰浴下超声破碎, 离心后取上清通过his·tag融合蛋白亲和纯化试剂盒纯化重组蛋白。sdspage分析表达产物的mr。
1.2.6 动物致敏 雄性wistar大鼠, 200 g左右, 实验开始时腹部皮下分3点注射0.5 ml卵清蛋白及氢氧化铝混合液(含卵清蛋白1 mg、 氢氧化铝200 mg), 同时腹腔注射上述混合液0.5 ml。免疫后14 d, 氯胺酮（5 mg/kg）麻醉, 无菌操作取肺。
1.2.7 组织消化与细胞分离 将新鲜切除的肺组织经dmem（含20 ml/l胎牛血清, 1×104u/l青霉素, 100 mg/l链霉素）冲洗后, 用剪刀在上述溶液中细细剪碎。组织块用上述dmem液洗涤3次（1500 r/min, 37℃, 5 min）后, 将其与ⅰ型胶原酶(1.5 g/l dmem, 10 ml dmem/g肺组织)、 透明质酸酶(用量为ⅰ型胶原酶的一半)、 20 ml/l胎牛血清及青霉素（1×104 u/l）、 链霉素（100 mg/l）混合, 在37℃培养箱中消化60 min, 并不时摇动。用孔径为100 μm的筛网将细胞与未消化的残留组织碎片分离开[6]。经3次洗涤（条件如前）后, 将细胞悬浮于含100 ml/l胎牛血清、 1×104 u/l青霉素, 100 mg/l链霉素的dmem中, 37℃培养约16 h。
1.2.8 不同浓度rhrf的准备 将纯化得到的重组rhrf用完全hbss（含1.8 mmol/l ca2+、 0.5 mmol/l mg2+）透析, 重组rhrf经稀释, 得到浓度梯度为20、 100、 200、 300及400 mg/l的溶液。每个浓度梯度各取0.5 ml加入离心管, 只含0.5 ml完全hbss的离心管则作为自发性和全部组胺释放的对照管, 操作完毕后置于4℃。
1.2.9 致敏肥大细胞的激活 取10 μl细胞悬液用等量台盼蓝染液染色3 min后, 用血细胞计数器在显微镜下计数, 计算活细胞百分比; 取10 μl细胞悬液用等量甲苯胺蓝染液染色10 min后, 用相同方法计数, 计算肥大细胞数占细胞总数的百分比。将细胞用含20 ml/l小牛血清的不全hbss（不含ca2+、 mg2+）和完全hbss依次洗涤1次后, 重悬于完全hbss中, 并调整细胞密度为25×106～50×106个肥大细胞/l。立即将细胞悬液加入预温至37℃的装有不同浓度rhrf的离心管及对照管中, 每管0.5 ml。轻轻混匀后开始计时, 37℃ 35 min后将离心管置冰浴终止反应, 并立即于4℃离心（2000 r/min, 10 min）, 分离上清液, 即刻进行组胺测定或-20℃保存。用于测定全部组胺释放的对照管则在反应35 min结束后, 煮沸5 min置冰浴冷却, 使细胞内组胺全部释放, 即测得全部组胺量。
1.2.10 组胺释放率测定 配制组胺标准溶液。取组胺标准液或待测上清0.8 ml加入0.4 ml naoh （0.4 mol/l）, 立即加入0.5 g/l邻苯二甲醛0.08 ml, 混匀, 室温放置10 min, 加入0.4 ml hcl （0.5 mol/l）终止反应。用荧光分光光度法进行比色（入射波长353 nm, 发射波长438 nm）, 作出标准曲线,并测定待测样品组胺释放量[7]。组胺释放率=[(组胺释放量－自发性组胺释放量)/全部组胺量]×100%。
2 结果
2.1 rtpcr扩增结果 以提取的大鼠肝组织总rna为模板进行扩增, 扩增的rhrf基因长度经12 g/l琼脂糖凝胶电泳鉴定, 与预期长度531 bp相符。
2.2 ta克隆 随机挑取12个重组pmd19t simple vector经pcr和酶切初步鉴定筛选后, 送其中9个重组克隆测序, 获得3个具有正确编码区序列的重组克隆。与genbank中大鼠ige依赖组胺释放因子mrna序列比较, 插入序列与其一致性为97%, 推测氨基酸序列一致性为95%。
2.3 表达质粒的鉴定 以重组质粒pet30arhrf为模板, pcr扩增出单一条带, 片段长度与预期长度一致。重组质粒用nde i、 xho i进行双酶切, 产生了5400 bp和500 bp2个片段（图1）。
图1 重组质粒的鉴定（略）
fig 1 identification of recombinant plasmid
1: dna marker dl 2000; 2: pet30a plasmid; 3: pet30arhrf digested by nde i; 4: pet30arhrf digested by nde i and xho i; 5: rhrf amplified by pcr (531 bp).
2.4 重组蛋白表达和纯化 从sdspage（图2）可见, 重组载体pet30arhrf经诱导可表达mr约24000的重组蛋白。尽管该重组蛋白可溶性表达水平较低, 但为确保纯化后蛋白的生物学活性, 本实验中仅对重组蛋白可溶性表达部分进行了纯化。
图2 重组蛋白rhrf的表达及纯化（略）
fig 2 expression and purification of recombinant rrhf
1: protein marker; 2: bl21(de3); 3: pet30a without iptg induction; 4: pet30a with iptg induction; 5: pet30arhrf without iptg induction; 6: pet30arhrf with iptg induction; 7: soluble fraction of the recombinant protein; 8: purified rrhf.
2.5 rhrf诱发致敏肥大细胞释放组胺 用酶消化法从大鼠肺组织分离肥大细胞, 所得到的活细胞数所占比例大于95%, 肥大细胞数占细胞总数的4%～5%。rhrf诱导致敏肥大细胞释放组胺(图3)。
图3 rhrf诱导致敏大鼠肥大细胞释放组胺的剂量依赖曲线（略）
fig 3 dosedependent curve of histamine release from sensitized rat mast cells by recombinant rhrf
3 讨论
ige依赖组胺释放因子, 或称tctp, 是在研究该蛋白生物学功能的不同方面时得到的不同命名。该蛋白在包括酵母在内的许多真核细胞生物中广泛表达[8], 其生物学功能具有多样性, 表现为: 参与分子间相互作用, 如与ca2+、 微管蛋白等结合; 调节细胞的增殖与分化, 与抑制细胞调亡和细胞恶性转化相关; 另外它作为分泌蛋白, 可发挥细胞因子样作用, 促进嗜碱性粒细胞、 嗜酸性粒细胞释放多种生物活性介质, 且与其他类型组胺释放因子无同源性。人体多种组织细胞如b细胞、 t细胞、 单核细胞、 成纤维细胞等均可转录ige依赖组胺释放因子mrna, 并且在ⅰ型超敏反应患者鼻腔分泌物、 支气管肺泡灌洗液以及变态反应性皮炎疱疹液中均可检测到高水平的该蛋白[9]。
肥大细胞是ⅰ型超敏反应的关键效应细胞之一, 可被fcεr1依赖性或非依赖性刺激剂活化。活化肥大细胞释放组胺多种活性介质, 除参与ⅰ型超敏反应如哮喘的速发相反应外, 还可通过其产生的细胞因子和趋化因子引起其他炎症细胞募集而参与迟发相和慢性炎症的形成。本研究中我们纯化获得的原核表达的可溶性重组rhrf具有生物学活性, 可诱导ova致敏的大鼠肥大细胞释放组胺而不依赖变应原的存在, 并且呈现剂量依赖关系, 为证实ige依赖组胺释放因子在ⅰ型超敏反应中的重要调节作用提供了新的依据。近来研究表明, ige依赖组胺释放因子的生物学活性可能并非依赖ige或fcεr1, 目前认为在这些细胞表面可能存在其特异性受体, 其诱导上述细胞活化和释放介质的信号转导机制值得深入研究。
【参考文献】
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