【摘要】 目的: 以羧甲基壳聚糖为基质材料, 制备apoptin基因缓释微球。方法: 采用复凝聚法制备apoptin/壳聚糖微球, 分别用光镜观察微球形态、 内切酶研究其稳定性、 dna电泳阻滞分析apoptin/壳聚糖最佳比例、 pcr测定apoptin基因作为复制摸板能力、 用mtt法检测其抗肿瘤活性。结果: 壳聚糖与apoptin基因可形成稳定的微球, 其直径在200～300 nm之间, 成球性较好、 apoptin/壳聚糖微球p/n最佳质量比为5.5∶1、 微球能够有效防止dna酶的降解作用、 apoptin/微球载体中的基因仍具有dna复制模板功能, 并能有效地转染a375细胞, 诱导a375细胞发生凋亡, 从而抑制瘤细胞生长。结论: apoptin基因与羧甲基壳聚糖可形成稳定的缓释微球, 并能有效地转染肿瘤细胞, 诱导肿瘤细胞发生凋亡。
【关键词】 羧甲基壳聚糖 基因载体 细胞凋亡
[abstract] aim: to construct the delivery nanoparticles system of apoptin gene with ocarboxymethylated chitosan(cmc) and study its effect on inducing apoptosis of human melanoma cells a375 in vitro. methods: cmc nanoparticles containing apoptin gene were prepared by an ultrasonic method. restriction enzymes, dna gel retardation assay and pcr were used to identify apoptin gene stability and to decide the best n/p ratio as well as the model effect in the progress of replication. human melanoma cells a375 are transiently transformed by nanoparticles containing apoptin gene and apoptosis was measured by mtt assay at various time period. results: morphology studies revealed that the particles were spherical in shape with smooth surface. the mean particle diameter ranged from 200-300 nm. the ratio of the chitosan to apoptin dna (n/p ratio) was 5.5∶1. the apoptin gene in chitosan/apoptin nanoparticles could be protected from dnase degradation and could be used as the model in the process of replication. the nanoparticles with apoptin gene could induce apoptosis of a375 cells in dosedependent manner in vitro at 48 h after transformation. conclusion: the chitosan vector and apoptin gene could be combined to be a safe gene delivery nanoparticles system, which could induce apoptosis in human melanoma cells a375.
[keywords]chitosan; gene delivery system; apoptosis
基因治疗是一种治疗人类疾病的新方法。wWw.11665.cOm要使基因进入缺损部位并持续作用, 最重要的一点是要有基因载体, 它能进入缺损细胞并与原有基因整合或持续释放表达的产物来发挥其治疗作用。目前用于基因治疗的载体有病毒性载体和非病毒性载体两大类。病毒载体由于具有选择复制缺陷性, 使复制产生的病毒蛋白导致机体免疫反应, 造成靶细胞损伤,转基因细胞数量减少, 继而使目的基因表达的持续时间相应缩短[1, 2]。病毒载体的上述致命缺陷, 使人们开始将目光转向非病毒基因载体系统的研究。有人用脂质体作为基因载体, 但存在的主要问题是脂质体的制备重复性和储存稳定性较差, 而且溶酶体可以使进入细胞的脂质体降解, 这就限制了脂质体作为基因载体的应用[3, 4]。 羧甲基壳聚糖是一种可生物降解的高分子材料, 是理想的非病毒基因载体侯选者。本实验的目的将羧甲基壳聚糖制备成携带apoptin基因微球, 并将其转染人黑素瘤细胞a375, 通过对细胞的转染情况进行体外检测, 以探讨其作为非病毒基因载体的可能性。
1 材料和方法
1.1 材料 o羧甲基壳聚糖(ocmc), 青岛海洋生物研究所惠赠;脂质体（lipofectmina）、 rtpcr试剂盒、 凋亡细胞dna提取试剂盒购于invitogen公司; 所用其他化学试剂均为国产分析纯。质粒pcdnaa3是本室构建, 内含有肿瘤特异性凋亡基因, 采用硷变性法大量提取质粒dna, 用peg沉淀法进行纯化, 所得质粒dna含量为2 g/l, 纯度达到电泳纯［5］。人黑素瘤细胞a375引自军事医学科学院, 本室传代保存, 用含有100 ml/l胎牛血清的prmi1640培养基在50 ml/l co2、 37℃传代培养。
1.2 方法
1.2.1 壳聚糖/apoptin微球的制备 将浓度为0.2 g/l ph6.5低分子量壳聚糖, 离心, 超声处理, 加入k2so4溶液和tween80, 快速旋转30 s, 形成空白的壳聚糖微球。然后将空白的壳聚糖微球超声处理后, 在55℃放置20 min, 在空白壳聚糖微球中按比例加入pdnaa3, 快速旋转30 s, 室温放置1 h。
1.2.2 微球的大小及形态观察 取微球少许, 用含有2 ml/l tween80的生理盐水分散, 在荧光显微镜下观察大小及形态。
1.2.3 壳聚糖与pdnaa3的质量比(n/p比)最适比例的测定 采用不同n/p比制备壳聚糖/apoptin微球, 通过dna电泳阻滞实验探索n/p最适比例。
1.2.4 抗dna酶降解的检测 将最适比例的微球用限制性内切酶apaⅰ和hind ⅲ进行酶切后用琼脂糖凝胶电泳分析。证明apoptin/壳聚糖微球中dna的稳定性。
1.2.5 微球中apoptin基因模板能力的检测 为了检测apoptin/壳聚糖微球能否影响pdnaa3中apoptin基因作为模板的能力, 进行了pcr检测。引物分别为up primerⅰ: gaattc atg aac gct ctc caa gaag; down primerⅱ: gtcgac tta cag tct tat acg cctt。
1.2.6 细胞瞬间转染 参照lipofectmina转染说明书进行。以2×105个细胞为一个单位进行转染。转染前24 h, 将a375细胞重铺在t25培养瓶中, 待细胞长至底面积80%时, 进行转染。用无血清dmem洗细胞2次, 加入5 ml无血清的dmem, 逐滴加入上述制备的apoptin羧甲基壳聚糖微球和apoptin分别进行转染, 每个单位细胞加1 ml（含有5 μg dna）, 边加边轻轻混合, 置37℃孵育8 h。弃去转染液, 换含100 ml/l新生牛血清的dmem培养液, 继续培养。分别于转染后24、 48和72 h, 观察并取转染细胞进行下列鉴定。用等量的不含apoptin基因的pcdna3.1空质粒作转染对照。
1.2.7 mtt法测apoptin载体对肿瘤细胞的抑制率 a375细胞用含100 ml/l胎牛血清的dmem培养液, 37℃、 50 ml/l co2条件下培养, 隔日传代1次。测试前24 h将a375细胞接种于96孔板, 每孔4×103个细胞。然后分别将各种浓度的apoptin羧甲基壳聚糖纳米微球或apoptin脂质体转染a375细胞, 每孔加入200 μl, 同一浓度重复4孔, 48 h后用mtt法检测各组的细胞凋亡率[6]。
1.2.8 统计学处理 计量资料用x±s表示, 多组间比较用方差分析, 两两比较用lsdt检验。
2 结果
2.1 apoptin/羧甲基壳聚糖微球的表征 微球的大小是影响转染率的一个重要因素, 若微球的半径过大, 对细胞内吞过程有不利的影响, 所以能够形成大小合适, 均匀的微球十分重要。通过显微镜观察, 壳聚糖微球大小均匀, 外表光滑, 直径在200～300 nm之间（图1）。
2.2 n/p最适比例确定 我们用n/p的比例代表带正电荷的壳聚糖的量与带负电荷的dna之间的比例。用dna电泳阻滞实验来确定壳聚糖的量与pdnaa3量的最适比例（即n/p的最适比例）。带正电荷的壳聚糖与带负电荷的dna之间主要是以静电吸引作用结合在一起的, 这可以用溴化乙啶与质粒竞争性缠绕的实验证明。leong等将壳聚糖加入混有溴化乙啶的dna溶液, 用荧光光度计检测发现荧光强度明显减小。由于静电吸引作用, 带正电荷的壳聚糖与带负电荷的dna之间这种结合使微球在琼脂糖凝胶电泳中被阻滞在上样口。由图2可见, 随着n/p比例的逐渐增大, 被阻滞的dna逐渐增多, 当到达n/p为5.5∶1的时候, 微球完全被阻滞在上样口, 不进胶。因此确定n/p的最适比例是5.5∶1。
图1 壳聚糖/apoptin微球显微照片（略）
fig 1 nanoparticles of apoptin gene with ocarboxymethylated chitosan（×400）
图2 dna电泳阻滞实验测定壳聚糖/apoptin微球n/p的最适比例图谱（略）
fig 2 dna gel retardation of chitosan/apoptin nanoparticles at different ratio between chitosan and apoptin
1-6: the ratio of n/p 6∶1, 5.5∶1, 5.0∶1, 4.5∶1, 3.5∶1, 2.5∶1; 7: dna marker.
2.3 抗dna酶切能力及pcr检测 壳聚糖/apoptin微球并没有被限制性内切酶破坏, 而没有连接壳聚糖的pdnaa3则被酶切。说明壳聚糖能够有效的防止dna酶对dna的降解, 这可能是由于壳聚糖与dna形成微球之后dna三级结构发生改变引起的空间阻碍（图3）。由图3可以看出, 微球中的dna还可以做模板, 这说明壳聚糖并没有破坏pdnaa3作为模板的能力。
图3 壳聚糖/apoptin微球内切酶酶切及pcr结果（略）
fig 3 restriction enzymes digestion and pcr of chitosan/apoptin nanoparticles
1: dna marker; 2: pdnaa3; 3: chitosan/apoptin nanoparticles digested with apaⅰand hind ⅲ; 4: pdnaa3 digested with apaⅰ and hind ⅲ; 5: chitosan/apoptin nanoparticles; 6: pcr of pdnaa3; 7: pcr of chitosan/apoptin nanoparticles.
2.4 mtt法测定apoptin/壳聚糖缓释微球对肿瘤细胞的抑制率 将携带apoptin基因的羧甲基壳聚糖微球转染a375细胞后, 与apoptin脂质体一样能有效地抑制a375细胞的生长, 两者间差异无统计学意义（p>0.05）; 与单纯载体 (即不携带apoptin基因的羧甲基壳聚糖微球)和pcdna3.1质粒比较差异有统计学意义(p<0.05, 表1)。而且其对a375细胞的抑制作用随apoptin羧甲基壳聚糖载体浓度的增加而增强（表2）。
表1 apoptin/壳聚糖缓释微球对肿瘤细胞的抑制率（略）
tab 1 inhibition effect of chitosan/apoptin nanoparticles on tumor cells
表2 不同剂量apoptin/壳聚糖缓释微球对肿瘤细胞的抑制率（略）
tab 2 inhibition effect of chitosan/apoptin nanoparticles on tumor cells at different dosage
3 讨论
来源于鸡贫血病毒（cav）vp3基因编码的小蛋白质具有特异性诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用,故称为肿瘤特异性凋亡蛋白（apoptin）[7]。apoptin的作用方式使它优于其他基因治疗方案, 因为理论上它对所有的肿瘤都应有明显的疗效, 因而显示出良好的临床应用前景。目前的研究中, 作为携带apoptin基因进行细胞转染的载体主要为病毒性载体, 如cmv、 重组h1细小病毒和腺病毒等。由于病毒性载体目前还存在着难以克服的缺点而阻碍了在临床上推广应用, 因此开展用非病毒载体将apoptin基因导入体内肿瘤细胞, 进行肿瘤基因治疗有重要意义。本课题组在前期工作中自行构建了含apoptin基因的真核表达质粒pcdnaa3, 并将该质粒用脂质体lipofectimine包裹, 进行肿瘤细胞的转染实验。结果表明通过这种方式, apopotin基因能成功地转染培养的人黑色素瘤细胞a375, 并具有明显的诱导凋亡活性[8]; 进而将这种脂质体pdna注射到s180荷瘤小鼠的瘤块中, 结果2周后治疗组的平均瘤质量仅为对照组的1/3, 并且其他脏器未见任何毒理作用[9]。
由于羧甲基壳聚糖有如下优点: (1)羧甲基壳聚糖都是具有良好生物相容性和生物降解性的高分子材料, 对人体无毒无害; (2)由于羧甲基壳聚糖带正电荷, 使其能通过静电吸附作用携带带负电荷的基因物质如寡核苷酸, 从而通过空间位阻效应, 防止体内dna酶对寡核苷酸的降解; (3)羧甲基壳聚糖为水溶性高分子, 可解决基因载体制备和转染过程中的沉淀问题; (4)羧甲基壳聚糖为多糖类物质, 可与某些肿瘤表面的多糖受体结合, 增加该类基因载体的肿瘤靶向性; (5)羧甲基壳聚糖是可生物降解的高分子材料, 可通过纳米生物技术达到基因的控制释放, 从而使基因治疗达到最佳效果。所以本研究以羧甲基壳聚糖作为apoptin基因的导入系统, 探索将apoptin基因制成疗效确切、 不良反应低、 用药便利的特异性抗肿瘤制剂。本实验结果证明, 低分子量壳聚糖能够有效的与含apoptin基因的质粒dna形成微球, 能够有效的防止限制性内切酶的降解, 微球中的dna仍然可作为模板, 壳聚糖/apoptin微球同脂质体一样能有效地转染a375细胞, 同时也能有效地诱导a375细胞发生凋亡, 从而有效的抑制a375细胞的生长。而将单纯的羧甲基壳聚糖加入培养的a375细胞, 对细胞的生长没有影响, 表明羧甲基壳聚糖对细胞的毒性很低。这些研究结果为o羧甲基壳聚糖纳米微球作为基因载体应用于疾病的基因治疗提供了依据。
【参考文献】
[1] pierre l, sylvie f, noufissa n, et al. gene delivery systems: bridging the gap between recombinant viruses and artificial vectors[j]. adv drug delve rev, 1998, 30（1）: 5- 11.
[2] truong l, walsh f, scott m, et al. gene transfer by dnagelatin nanospheres[j]. arch biochem biophys, 1999, 361(1): 47-56.
[3] colin wp, leonard ws. key issues in nonviral gene delivery[j]. adv drug delve rev, 1998, 34(1): 3-19.
[4] cristiano g, richard j. targeted noviral gene delivery for cancer gene therapy[j]. front biosci, 1998, 3（2）: 1161-1170.
[5] sambrook j, fritsch ef, maniatis t. molecular cloning.printed in the united states of america[m]. new york: cold spring harbor lab press, 1989: 310-328.
[6] 赵洪礼, 等主编. 现代基础医学常用实验技术[m]. 北京: 科学出版社出版, 2002: 210-218.
[7] danenvan oorschot aaam, grimbergen jm, fisher df, et al. the chicken anemia virus derived protein apoptin requires activation of caspases for induction of apoptosis in human tumor cells[j]. virol, 2000, 74(3): 7072-7078.
[8] 聂 晶, 崔旭红, 赵洪礼, 等. 肿瘤特异性凋亡基因黑色素瘤细胞凋亡诱导作用[j].
