【摘要】 【目的】研究利用浓差法中的减量法（即体内研究中的反向透析法）测定烟碱微透析回收率的可行性，并考察回收率测定中的相关影响因素，为烟碱的体内微透析研究提供实验依据。【方法】分别采用浓差法（增量法、减量法）测定烟碱的体外回收率，考察灌流液预处理及流速、浓度对其影响，并考察回收率的稳定性。【结果】滤过、搅拌能有效提高体外回收率，超声时间对回收率影响不大；增量法及减量法测定的回收率一致；回收率与媒介中烟碱的浓度无关，稳定性良好。【结论】实验时有必要滤过灌流液，对灌流液进行超声或以其他方式脱气。反向透析法可作为体内微透析研究中烟碱回收率的测定方法。
【关键词】 烟碱/分析 微透析 色谱法 高压液相
abstract∶objective to detect the invitro microdialysis recovery of nicotine by decrement method (ie.retrodialysis) and to investigate its influence factors, thus to supply experimental evidence for the invivo microdialysis of nicotine. methods the invitro recovery of nicotine was detected by concentration difference method (increment method and decrement method).the stability of recovery was observed. the effects of the pretreatment with perfusate, and the flow rates and concentrations of the perfusate on nicotine recovery were studied.resultsfiltering and stirring treatment increased the recovery, but the time of ultrasound degassing showed no effect on the recovery. the recovery detected by increment method was as the same as that detected by decrement method. nicotine recovery was independent of nicotine concentration in the external medium, showing good stability.conclusionit is necessary to filter and degas the perfusate before microdialysis. retrodialysis can be used for the determination of invivo nicotine recovery．
key words∶nicotine/analysis；mierodialysis；chromatography,high pressure liquid
微透析(microdialysis) 技术是一种在不破坏生物体内环境的前提下,对生物体细胞间液(ecf)的内源性或外源性物质进行连续取样和分析的检测技术。WWW.11665.com它是以透析原理作为基础的在体取样技术,在组织中植入配有半透膜的探针(probe),体外微量泵使灌流液(perfusate)流经探针,小分子物质能沿浓度梯度通过半透膜到达另一端,而大分子物质则不能通过,这样完成在半透膜两端灌流液与组织液之间物质的交换。在流出端收集透析液(dialysate)并检测其中的药物浓度,通过探针的回收率(recovery)则可以计算组织中药物的浓度 ［1］ 。
目前认为,烟草中的烟碱是导致吸烟成瘾的生物碱,尼古丁替代治疗(nicotinereplacement)是世界卫生组织(who)推荐的戒烟治疗方法,也是美国食品药品管理局(fda)批准的治疗方案,其治疗方法是在停止吸烟的同时使用烟碱制剂 ［2］。近来将微透析采样应用于药物动力学研究成为目前微透析研究的热点,为了考察用反透析法测定烟碱体内回收率的合理性和将微透析采样技术应用于烟碱相关制剂体内药物动力学研究的可行性,以及对体内研究的各种参数进行优化,本研究对烟碱微透析回收率的体外测定方法及影响因素进行研究,现报道如下。
1 仪器和试剂
1.1 药物和试剂烟碱对照品含量990%,德国drehrenstorfer公司生产,批号：61219，甲醇色谱级,美国dima technology inc生产,购于北京迪科马科技有限公司。
1.2 微透析系统微透析设备(瑞典cma公司)包括：线性探针(cma30 linear microdialysis probe)、活性透析膜(长度为10 mm、直径为024mm)；灌流液为林格氏液 (分别称取8591 g nac1、0255 g cac12、0298 g kc1溶解于超纯水中,并定容至1 000 ml,用022 μm的水系微孔滤膜过滤即得)，临用前配制,烟碱在每次实验前加入；其他主要部分：灌注器推进泵(cma 402 syringe pump),灌注器(cma 10 ml exmire microsyringe,msgan100)。
1.3 其他仪器summit p680型高效液相色谱仪(hplc),包括p680泵、uvd170 u可变波长紫外检测器、chromeceon色谱工作站, 由德国dionex公司生产；色谱柱为phenomenex luna cl8(2)100a(46 mm×250 mm,5 μm)柱；phenomenex 保护柱由广州菲罗门科学仪器有限公司提供；901型恒温磁力搅拌器由上海沪西分析仪器厂提供；phs25型ph计由上海雷磁仪器厂提供；kq5200de型数控超声波清洗器由昆山市超声仪器有限公司提供。
2 方法和结果
2.1 样品分析方法色谱条件为流动相：甲醇—水(含三乙胺003 mol/l,用磷酸调ph 65)，体积比为60∶40，流速：10 ml/min，检测波长：262 nm，进样量：10 μl。在该色谱条件下,烟碱峰形好,不拖尾,出峰时间约为55 min。该系统的最低检测限量能够满足本研究中可能达到的最低浓度。
2.1.1 标准曲线的建立精密称取烟碱标准品5204 mg,用甲醇定容到100 ml,制成标准品母液。分别从母液中精密量取适量置于容量瓶中用甲醇定容,配成0026 02、0052 04、0208 16、0312 24、0416 32 mg/ml的标准品溶液,以10 μl进样,采用hplc法测定(每种浓度进样量测定2次,取其平均值)。以峰面积积分值(auc)为纵坐标(y),浓度为横坐标(x),绘制标准曲线,得回归方程：y=15267x+0241 6,r=0999 8。结果表明,烟碱在0026 02～0416 32 mg/ml的浓度范围内线性关系良好。
2.1.2 精密度试验取浓度为0416 3 mg/ml的标准品连续进样5次,每次10 μl,测得峰面积的sr为045%,精密度好。
2.2 灌流液预处理对回收率的影响
2.2.1 过滤对微透析探针回收率的影响将微透析探针浸渍于浓度为03 mg/ml的烟碱林格氏液中,分别以3 μl/min的流速灌流未过滤及以045、022 μm水系微孔滤膜过滤的空白林格氏液,每种灌流液下平衡30 min后收集4份透析液,每份30 μl,测定透析液浓度(ρdialysate)及探针周围透析媒体烟碱林格氏液的浓度(ρecf)。结果见表1。表1过滤对烟碱体外回收率的影响（略）
2.2.2 超声脱气时间对微透析探针回收率的影响将微透析探针浸渍于浓度为03 mg/ml的烟碱林格氏液中,分别以3 μl/min的流速灌流未超声及超声15、30 min的空白林格氏液,样品收集及测定同221项。结果见表2。表2超声脱气对烟碱体外回收率的影响（略）
2.2.3 搅拌速率对微透析探针回收率的影响将微透析探针浸渍于浓度为03 mg/ml的烟碱林格氏液中,分别未搅拌及搅拌烧杯中的含药林格氏液,均以3 μl/min的流速灌流空白林格氏液,样品收集及测定同221项。按下列公式计算相对回收率：p回收=ρdialysate/ρecf×100%（公式1）。结果见表3。表3搅拌对烟碱体外回收率的影响（略）
表1～表3结果显示：过滤可明显提高相对回收率,超声脱气也能提高回收率,但超声时间的长短对回收率影响不大,搅拌也能提高回收率。故在实验时,有必要过滤灌流液,对灌流液进行超声或以其他方式脱气,体外实验需充分搅拌。
2.3 浓差法(增量法、减量法)考察流速对回收率的影响
2.3增 量法测定流速对回收率的影响将微透析探针浸渍于含有烟碱(04 mg/ml,ρecf)的林格氏液中,用空白林格氏液在不同流速(05、1、2、3、4 μl/min)下灌注探针。每更换1次流速平衡30 min,在每种流速下收集4份透析液样品(每次30 μl ),利用hplc法测定透析液中烟碱含量(ρdialysate)。采用公式1计算增量法烟碱回收率。
2.3.2 减量法（即体内研究中的反向透析法）测定流速对回收率的影响将探针浸渍入空白林格氏液中,并用含有烟碱的林格氏液(04 mg/ml,ρperfusate)灌注探针。收集微透析液样品(30 μl)并检测其中烟碱的含量(ρdialysate)。流速以及收集样品的间隔与增量法中所用的相同。通过减量法计算烟碱的回收率：p回收=(ρperfusate-ρdidysate)/ρperfusate×100% (公式2)。结果见图1。
通过增量法及减量法进行的烟碱探针回收率的测定结果发现,随着流速的增加,回收率呈指数降低,且两种方法测得回收率在各种流速下均基本一致,这为反向透析法测定烟碱体内回收率提供了实验依据。
2.4 浓度对回收率的影响将探针依次浸入到包含4种不同浓度烟碱(依次为01、02、03、04 mg/ml)的林格氏液中,用空白林格氏液以3 μl/min的流速灌注探针,每种浓度下平衡30 min后收集4份微透析液样品,每份30 μl,测定透析液中的烟碱浓度。按增量法公式1计算烟碱的回收率,结果见图2。当以3 μl/min的速度对探针进行灌注时,在4个透析媒体的浓度条件下,回收率的测定结果为(2221±073)％。通过对透析液浓度与透析媒体浓度进行线性回归,显示两者之间的线性关系良好,r=0999 1。可见,在所研究的浓度范围之内(0098 1～0408 8 mg/ml),烟碱的回收率与浓度无关(图3)。图2增量法测定浓度对回收率的影响
2．5 回收率的日内稳定性体内微透析试验持续的时间一般较长,同一根探针常常需要连续取样几个小时,如果在长时间的取样过程中回收率发生较大的变化,就会失去微透析技术本身的意义［1］。因此,有必要考察烟碱回收率的稳定性。
将探针置入含有烟碱的林格氏液(03 mg/ml,ρecf)中,用空白林格氏液以2 μl/min的流速灌注探针,每次收集透析样品30 μl ,灌流时间在8 h以上。测定透析液中烟碱的浓度(ρdialysate),通过增量法公式1计算回收率,结果见图4。当探针的灌流速度为2 μl/min时,回收率为(4252±193)％,探针的效能保持稳定达8 h以上。说明烟碱的探针回收率日内稳定性可以满足要求。
3 讨论
烟碱分子由两个氮杂环构成,其中吡啶环上的氮原子由于芳香化的结果,碱性较弱,电离常数(pka)值为3,而吡咯氮杂环连接一个甲基,且没有芳香性,在水溶液中其pka值约为8。吡咯氮与色谱柱上残余硅羟基的氢键键合而导致了拖尾。三乙胺作为改性剂,可隐蔽引起2次保留的硅羟基,但在不同ph条件下三乙胺与烟碱的竞争能力有所不同［3］。
微透析技术作为一种直接进行细胞外液采样分析的方法,在局部药动学研究中具有其他药动学方法难以取代的地位［4］。探针的回收率是将微透析技术应用于药动学研究的一个关键问题。回收率受多种因素影响。实验证明,灌流液的前处理会影响探针的回收率。滤过灌流液可以除去大分子杂质,提高探针回收率,并对探针膜有一定的保护作用。在微透析实验中,流速缓慢,样品很微量,一个很小的气泡都会对测定结果有很大的影响,所以很有必要对灌流液来用超声等方法进行脱气。为保证与体内环境的相似性,体外实验还必须对透析媒介进行搅拌,以确保浓度的均匀性。灌流液的流速是影响探针回收率大小的重要因素之一。灌流液的流速越快,其流经半透膜时,膜内外药物的平衡时间就越短,导致回收率越低。
在体内微透析实验中,由于探针外部的药物浓度(ρecf )是未知的,所以一般是通过反向透析法测定药物经过半透膜时的流失量来间接计算探针的回收率。反向透析法的理论基础就是基于探针的回收率等于探针的释放率这一假设的［5］。在一般情况下,药物的回收率是等于其释放率的,但也有特殊情况［6］,因此在利用反向透析法测定某种药物的回收率之前,必须先验证其回收率与释放率是否相等(通常可通过体外测定来完成),否则利用反向透析法测定回收率的结果是不可信的。同时回收率与透析媒介的浓度无关也是反向透析法测定体内回收率的基础。本研究通过体外实验证明了这两点,确定了在体内研究中反向透析法可作为烟碱的回收率测定方法。
本实验结果表明,流速越低,探针的回收率则越高,从而越有利于提高检测的灵敏度,但这样在体内实验时就会因采样间隔过长而丢失部分浓度变化信息。因此,在体内实验时,要综合考虑这两个因素,在尽量提高探针回收率的同时,保证能及时反映体内的浓度变化(即采样间隔不宜过长)。
【参考文献】
［1］ 晏亦林,叶勇,周莉玲,等.磷酸川芎嗪微透析体外回收率的研究［j］.中药新药与临床药理,2008,19(2):117．
［2］ 郭松,孙洪强,姜佐宁,等. 尼古丁替代治疗制剂的新进展［j］.中国新药杂志,2004,13(7):580．
［3］ 陈燕舞,尹笃林卜,廉世勋,等.反相高效液相色谱法测定烟草中烟碱的优化［j］.湖南师范大学自然科学学报,2005,28(3):52.
［4］ 凌家俊,李锐,周莉玲.青藤碱微透析回收率测定方法的体外模拟实验［j］. 广州中医药大学学报,2005,22(1):56．
［5］ 张英丰,周莉玲.温度及灌流液改性剂对青藤碱微透析探针体外物质转移系数的影响［j］. 广州中医药大学学报,2006,23(4):332．
［6］ plock n, buerger c, kloft c. successful management of discovered ph dependence in vancomycin recovery studies: novel hplc method for microdialysis and plasma samples［j］. biomed chromatogr, 2005, 19: 237．
