的：探讨分泌r-ifn的结核杆菌特异性t细胞检测对儿童结核感染的诊断意义。方法：用流式细胞术胞内细胞因子（cytokine flow cytometry，cfc）检测法，对结核病患儿41例、潜伏结核感染（latent tuberculosis infection，ltbi）75例、健康儿童20例，测其外周血中分泌r-干扰素（ifn-r）的结核杆菌特异性cd4+t淋巴细胞；同时行结核菌素皮试（tst）和结核抗体检测。结果：（1）cfc检测，41例结核病患儿90.24%阳性，9.76%阴性；健康组1例阳性，说明该检测方法特异性为95%。（2）结核病组cfc阳性率90.24%，tst阳性率70.73%，结核抗体阳性率56.10%，与cfc比较差异均有统计学意义（p<0.05）。（3）ltbi组cfc阳性率85.33%，tst阳性率85.33%；结核抗体阳性率为28%，与cfc比较差异有统计学意义（p<0.01）。结论：（1）诊断儿童结核病，分泌r-ifn的结核杆菌特异性t细胞流式检测的敏感性、特异性比tst、结核抗体强。（2）诊断潜伏结核感染，分泌r-ifn的结核杆菌特异性t细胞流式检测与tst效果类似，比结核抗体强。
　　【关键词】 特异性t细胞； 流式细胞术； 结核； 儿童； 诊断
　　结核菌素皮试（tst）是诊断儿童结核病传统的免疫学诊断方法，但其敏感性和特异性受诸多因素的影响：如非结核分枝杆菌感染有交叉阳性；急性粟粒性肺结核、结核性脑膜炎（tmb）患者可为假阴性反应。培养结核杆菌是诊断结核的金标准，但需要时间长，且阳性率低。www.11665.CoM因此，寻找新的特异性高、敏感性强、快速的结核感染诊断方法成为儿科医生关注的热点。
　　mahairas等在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌中名为“rd1”的基因序列[1]，该序列编码产生两种蛋白：早期分泌型抗原靶蛋白（esat-6）和培养滤过蛋白10（cfp-10），这两种蛋白作为特异性抗原可刺激机体特异性t细胞产生ifn-r。体外检测ifn-r释放的方法，逐渐成为结核病早期诊断研究的新方向。
　　本实验通过建立流式细胞术胞内细胞因子检测法（cytokine flow cytometry cfc），检测结核病组、潜伏结核感染组、健康对照组三组外周血分泌r-干扰素（ifn-r）的结核杆菌特异性cd4+t细胞比例。同时将cfc检测法结果与tst、结核抗体结果进行对比分析，探讨cfc检测分泌ifn-r的结核杆菌特异性t细胞在儿童结核病及潜伏结核感染中的诊断价值。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料 2008年1月-2010年1月苏州大学附属儿童医院门诊及住院部0～14岁健康对照组20例；潜伏结核感染患儿75例，疑似结核病患儿86例。
　　1.1.1 纳入标准 临床疑似结核病纳入标准，至少具有以下2项或2项以上表现：（1）发热或咳嗽2周以上；（2）胸部x线检查有疑似肺结核的征象；（3）临床上有脑膜炎/脑炎表现、脑脊液改变符合结核性脑膜炎；（4）颈淋巴结肿大，tst阳性；（5）关节疼痛伴影像学检查提示结核。潜伏结核感染者纳入标准：tst阳性除外卡介苗接种后反应，x线胸片临床无活动性结核病证据，视为潜伏结核感染[2]。健康对照组来源于本院儿童保健门诊健康体检者，卡疤阳性，既往无结核病史及结核病接触史，无基础疾病。
　　1.1.2 所有入选对象均已接种bcg，并记录详细的临床资料。综合临床资料及相关检查，最终诊断为结核病者41例（抗结核治疗有效），其中肺结核病17例，肺外结核病24例。进行以下分组：a组：结核病组，41例，男22例，女19例，年龄5个月～14岁，平均（5.05±2.43岁），其中肺外结核病24例（结核性腹膜炎1例、骨关节结核2例、淋巴结结核6例、结核性脑膜炎15例）。肺结核17例（血性播散型肺结核1例、结核性胸膜炎4例、原发性肺结核12例）。b组：潜伏结核感染组75例，男44例，女31例，年龄2个月～14岁，平均（4.76±3.69）岁。c组：健康对照组20例，男13例，女7例，年龄2个月～14岁，平均（3.82±2.56）岁。
　　1.2 方法 每组研究对象均进行cfc、tst及结核抗体检测，治疗随访3～6个月。
　　1.2.1 cfc检测法所用试剂 esat-6、cfp-10结核杆菌特异性抗原（上海复兴医学诊断有限公司）；离子酶素（ino1μg/ml）（美国sigma 公司）；brefeldin（bfa）（美国sigma 公司）；fastimmunifn-r-fitc-cd69pe-cd4pepcr-cy5.5（美国bd公司）。
　　cfc检测法简要步骤：肝素钠抗凝真空管采集入选患儿外周血1 ml，取三只流式测定管：（1）刺激管：0.2 ml肝素钠抗凝全血，加入结核杆菌特异性抗原（esat-6+cfp-10各50 μl）刺激，加入

10 μl 0.5 mg/ml bfa阻断剂；（2）未刺激管：0.2 ml肝素钠抗凝全血，加入10 μl 0.5 mg/ml bfa阻断剂。5% co2、37 ℃，温箱培养 4～6 h，抗原刺激管培养24 h（温箱，松盖）。（3）阳性对照管：0.2 ml肝素钠抗凝全血，加入佛波酯（pma 20 ng/ml）、离子酶素（ino 1 μg/ml）共刺激，加入10 μl 0.5 mg/ml brefeldin（bfa）。每管均加入荧光标记抗体-fastimmunifn-r-fitc-cd69pe-cd4pepcr-cy5.5，并加入破膜剂、固定剂，上流式细胞仪检测。调节流式细胞仪前向（fs）、侧向（ss）2个参数的电压值，使绝大多数淋巴细胞显示在fs/ss双参数点图中。构建ifn-r fitc与cd69-pe直方图，在图中识别出已被活化的cd4+/cd69+细胞，构建ifn-r fitc单参数直方图。计数cd4+细胞，同时计数cd69-pe、ifn-r fitc双阳性细胞为对esat-6、cfp-10抗原肽有特异性的t细胞，并以占总计数的cd4+细胞的百分比表示。 菌素皮试（tst） 试剂 卡介苗纯蛋白衍化物（ppd 50 iu/1ml成都蓉生生物制品研究所）。用ppd 0.1 ml（5 iu）皮内注射，48～72 h观察结果。
　　1.2.3 结核抗体检测试剂 结核分枝杆菌igg抗体检测试剂盒（蛋白芯片 南京大渊生物技术公司），检测受试者血清中的重组蛋白抗原16 kd和38 kd蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖（lam）抗体。
　　1.3 统计学处理 采用spss 13.0统计软件进行数据分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料采用 字2检验。检验水准α=0.05，p<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 cfc检测法各组阳性率结果及比较见表1。
　　2.2 各组分泌ifn-r的cd4+t细胞比例分析及比较 各组样本经结核杆菌特异性抗原刺激后，用cfc检测分泌ifn-r的结核杆菌特异性cd4+t细胞比例。健康对照组为（0.038±0.035）%，结核病组为（0.528±0.387）%，潜伏结核感染组为（0.510±0.364）%，经统计学分析（两组独立样本t检验）发现，潜伏结核感染组与健康对照组比较，差异有统计学意义（t=3.87，p<0.05）；结核病组与健康对照组比较，差异有统计学意义（t=2.65，p<0.05）。图1、图2为典型流式结果图。
　　2.3 cfc检测法与tst、结核抗体检测进行对比分析
　　2.3.1 41例结核病患儿同时行tst、结核抗体检测并与cfc检测进行对比分析，结果显示：结核病组cfc检测法阳性率为90.24%，tst阳性率为70.73%，两者比较差异有统计学意义（p<0.05）；结核抗体检测阳性率为56.10%，与cfc比较差异有统计学意义（p<0.05）；肺结核病组cfc检测法阳性率为94.12%，肺外结核组为87.5%，两者比较差异无统计学意义（p>0.05），见表2、3、4、5。
　　2.3.2 75例潜伏结核感染患儿结核抗体阳性者22例，阳性率为29.33%（22/75），而cfc阳性者64例，阳性率为85.33%，两者比较差异有统计学意义（p<0.05）。见表6。
　　2.4 cfc检测与tst、结核抗体结果一致性比较 潜伏结核感染组，cfc检测法与tst结果一致性为85.33%，与结核抗体检测结果的一致性为38.67%。结核病组，cfc检测法与tst结果一致性为70.73%，与结核抗体检测结果的一致性为51.22%，详见表7、8。
　　3 讨论
　　人感染了结核分枝杆菌后，具有免疫活性的t淋巴细胞识别结核菌特异性抗原并产生高水平的ifn-γ[3-4]。应用esat-6和cfp-10等rd1区域编码蛋白作为特异性抗原进行的以t淋巴细胞为基础体外检测ifn-r释放的方法（in vitro t-cell-based interferon-r release assays，即igra），已成为国内外结核病诊断方面研究的热点。本研究与igra原理相同：结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异性t细胞，这些t细胞在受到结核杆菌特异性抗原刺激后分泌ifn-r，利用流式细胞术检测分泌ifn-r的结核杆菌特异性t细胞的阳性比例，对儿童结核感染作出辅助诊断。
　　本研究用cfc法检测41名结核病患儿、75名潜伏结核感染患儿、20例健康对照者外周血（经结核杆菌特异性抗原刺激后）分泌ifn-r的结核杆菌特异性t淋巴细胞阳性率，结果显示，cfc法具有较高的灵敏度（90.24%）和特异度（95.0%），而且整个检测过程，仅需24 h，与国外报道一致[5-7]。由于每份标本采用阴性、阳性对照，结果更加可靠、操作简便。
　　结核病组，cfc阳性率为90.24%（其中17例肺结核，cfc16例阳性，阳性率为94.12%；24例肺外结核，21例cfc阳性，阳性率87.5%），tst阳性率为70.73%，结核抗体阳性率为56

.10%，前者与后两者相比，差异有统计学意义（p<0.05），说明cfc诊断结核病的阳性率高于tst及结核抗体，可做为结核病诊断的重要辅助检测手段。潜伏结核感染组，cfc阳性率为85.33%，与tst有较好的一致性。 结核抗体检测为体外免疫学试验，是采用蛋白芯片法进行体液免疫检测，越来越多的研究表明，结核抗体检测虽然特异性较高，但缺乏敏感性。影响结核抗体检测敏感性与特异性的主要原因与试剂所采用的结核菌抗原成分特异性不高有关[4]。本研究比较了结核抗体的阳性率和cfc阳性率，结果显示，结核病组前者的阳性率为56.10%，后者的阳性率为90.24%，两者比较差异有统计学意义（p<0.05）；潜伏结核感染组，前者阳性率为29.33%，后者阳性率为85.33%，两者比较差异有统计学意义（p<0.05）。提示对于潜伏结核感染、结核病的诊断，cfc优于结核抗体。
　　临床诊断结核病在于早期、准确地提供结核感染证据。本研究运用esat-6、cfp-10两种结核杆菌特异性抗原为刺激抗原，设计了流式细胞术胞内细胞因子检测（cfc）法，其原理是在有细胞因子封闭剂bfa存在的条件下，加入刺激抗原（esat-6、cfp-10）和协同刺激剂（cd28/cd49d）进行抗原刺激，通过使用荧光标记抗体对胞内细胞因子进行荧光标记染色，表达cd69，并分泌ifn-r的阳性细胞为结核杆菌特异性t细胞。本法的特点是利用流式细胞仪的多参数同时分析的功能，精确识别目标细胞并检测其内细胞因子分泌情况。本研究显示，在诊断儿童结核病，分泌r-ifn的结核杆菌特异性t细胞流式检测的敏感性、特异性比tst、结核抗体强。在诊断潜伏结核感染，分泌r-ifn的结核杆菌特异性t细胞流式检测与tst效果类似，比结核抗体强。
　　参考文献
　　[1] leung w l，law k l，leung v s，et al.comparison of intracellular cytokine flow cytometry and an enzyme immunoassay for evaluation of cellular immune response to active tuberculosis[j].clin vac immunol，2009，16（3）：344-351.