【摘要】 目的：探讨动脉粥样硬化中重要炎性物质——热休克蛋白60(hsp60)体外对小鼠树突状细胞(mdc)功能影响。方法：小鼠骨髓提取dc，体外培养成熟后与两种浓度mhsp60孵育，动态观察dc突起改变；流式细胞仪检测孵育前后mdc表面标志改变；mlr测定孵育前后mdc刺激功能变化；elisa法测定mlr上清液中细胞因子浓度。结果：孵育后，mdc突起增加明显；cd11c+、cd80及cd86表型显著增加；淋巴细胞刺激功能明显增强；分泌细胞因子il12、ifnγ增加（p<0.01）而il4增加不明显(p>0.05)，ifnγ/il4比值升高。结论：mhsp60体外可以促进mdc功能，作用呈剂量依赖性。
【关键词】 热休克蛋白60 树突状细胞 动脉粥样硬化 表型 细胞因子
effect of heat shock protein 60 on murine dendritic cell function in vitro
wu wei, li dazhu, zhou you, zeng qiutang.
department of cardiology, union hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430022, china
［abstract］ objective:to investigate the effect of heat shock protein 60(hsp60), significant inflammatory factor in atherosclerosis, on the maturation of murine dendritic cells(mdcs) in vitro.methods:myeloid mdcs were extracted in vitro from mouse marrow and incubated to mature with two distinct concentrations of mhsp60.the morphological changes were observed;the variation of phenotype was detected with flow cytometric analysis; the stimulating capacity was determined in allogenic mixed lymphocyte reaction(mlr); elisa was used to analyze the level of cytokines secreted by mdcs and stimulated lymphocyte in the medium of mlr.results:dendrites of mhsp60dcs raised obviously. the expression of costimulating factor cd11c+, cd86, cd80 was upregulated. the stimulating capacity of mhspdcs in mlr was higher. t lymphocytes cocultured with mhspdcs in mlr secreted higher levels of proinflammation cytokines(ifnγ, il12) but there were no significant difference of il4, the stimulatory action was dose dependent and was evident at higher concentrations. the ratio of ifnγ/il4 was increased.conclusion:mhsp60 progressed the maturation of mdc dosedependently in vitro.
［key words］ heat shock protein 60；dendritic cells；atherosclerosis；phenotype；cytokines
研究表明，动脉粥样硬化（atherosclerosis, as）的发生和发展与炎症免疫反应密切相关。WWw.11665.CoM树突状细胞（dendritic cells ,dc）作为最强的专职抗原提呈细胞能有效刺激初始t细胞对异体及自身抗原产生免疫应答，维持免疫平衡［1］。许多证据证明dc聚集在粥样斑块的局部，冠心病者循环亦存在dc激活的证据，提示dc在动脉粥样硬化的炎性反应中起重要作用。动脉粥样硬化时dc的激活抗原尚不清楚［2］。已知动脉粥样硬化斑块中存在热休克蛋白(heat shock protein, hsp)60，冠心病者循环中存在抗hsp60抗体，故认为hsp60是动脉粥样硬化的相关抗原之一［3］。hsp60对dc的作用国内尚无报道，本文探讨其对小鼠dc成熟和免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料及主要试剂 10周龄雄性c57bl/6j鼠购自北京维通利华实验动物有限公司；rmgmcsf和rmil4购自biosource公司；fitcanti mouse cd11c+、peanti mouse cd80及peanti mouse cd86购自biolegend公司；mhsp60购自stressgen公司；il4、ifnγ、il12 elisa试剂盒购自r&d公司。完全培养基包括：rpmi1640(gibco公司)，20%胎牛血清(gibco公司)，青霉素100 u/ml，链霉素100 u/ml，20 ng/ml rmgmcsf，20 ng/ml rmil4。
1.2 方法
1.2.1 小鼠骨髓dc培养 参照文献［4］方法稍做改进。简言之，取小鼠股骨和胫骨，去掉骨两端，用5 ml注射器吸取rpmi1640液冲洗髓腔，收集所得液体，200目尼龙网过滤后，trisnh4cl溶解红细胞，细胞悬于20%胎牛血清rpmi1640培养液中，种植于50 ml培养瓶中，置于37℃、5%co2孵育箱中，过夜后，弃去悬浮细胞，再加3 ml新鲜完全培养基，37℃、5%co2温箱培养，隔天半量换液，每次换液均保留细胞悬液直至第9天。
1.2.2 实验分组及细胞处理 将培养第9天的细胞分为3组：①对照组：培养液加pbs；②高剂量组：培养液加mhsp60 10 μg/ml；③低剂量组：培养液加mhsp60 3 μg/ml。3组均孵育24小时后保留细胞悬液。
1.2.3 形态观察 培养3、5、9和10天，用倒置显微镜，电镜和fitcanti cd11c+荧光染色后在荧光显微镜下观察dc形态。
1.2.4 流式细胞仪检测（fasc） 收集细胞调整密度为1×106 ml-1，每管为100 μl，加入标记抗体fitccd11c+、pecd80及pecd86，各0.1 μg，4℃孵育20分钟，pbs洗2遍，加入0.5 ml pbs重悬，美国becton dickinson公司流式细胞仪双标检测mdc的表型，以cd11c+设门，cellquest软件分析。
1.2.5 同种混合淋巴反应（mlr） 取近交系balb/c小鼠脾脏匀浆过滤后，去除红细胞培养2～3小时后取悬浮细胞，即淋巴细胞作为反应细胞。调整淋巴细胞为105/孔，mdc为104/孔，在96孔培养板中37℃、5%co2孵育96小时，取上清液保存，-70℃测细胞因子；再于每孔中加入mtt 20 μl，混匀后，37℃、5%co2孵育4小时，加dmso溶解后，560 nm波长检测a值。
1.2.6 细胞因子的检测 按照elisa试剂盒说明检测细胞培养液及mlr的上清液中il4、ifnγ和il12水平。以加pbs的细胞悬液为对照组，mhsp60孵育后的细胞悬液为处理组，并按浓度不同分为2组。
1.2.7 统计分析 使用spss 10.5统计软件统计分析。数据用x±s表示，组间比较用t检验。
2 结果
2.1 dc形态观察
2.1.1 倒置显微镜下观察 培养第3天可见细胞成簇生长，由圆形变为不规则形，并长出一些小刺状结构，细胞质变得丰富；培养第5天，树突样结构更加明显，胞质更加丰富；培养第9天，细胞数目增加显著，开始有部分悬浮或半贴壁；孵育后，即第10天，细胞大部分悬浮或半贴壁，少数贴壁，见图1。
2.1.2 荧光显微镜观察 处理组可见细胞成簇生长，细胞形态不规则，周边成毛刺状，低剂量与高剂量无明显差别；未处理组细胞成簇生长，细胞形态椭圆形，细胞核似蚕豆状，毛刺状不明显，见图2。
2.1.3 电镜观察 处理组细胞核呈分叶状，内吞区域多，细胞表面突起明显；未处理组细胞核圆，内吞区域少，细胞表面突起较处理组为少，见图3。
图1 倒置显微镜下观察细胞形态变化(×10)（略）
fig.1 morphologic change of mdcs by inverted microscope(×10)
note:mdcs on day 10 of culture(incubated with mhsp60).
图2 荧光显微镜观察(×40)（略）
fig.2 mdcs observed by fluorescence microscope(×40)
note:mdcs(incubated with mhsp60) stained by fluorchrome fitccd11c+.
图3 电镜观察(×4 000)（略）
fig.3 mdcs observed by electron microscope(×4 000)
note:mdcs(incubated with mhsp60) stained by transmission electron microscope.
图4 热休克蛋白对树突状细胞成熟表型的影响（略）
fig.4 hsp effect on phenotype of mdcs maturation
note:graph a and b display cd86 and cd80 expression of mdcs, respectively. graph a shows cd86 positive, 43.1% in control group, 59.7% in lowdose group and 87.2% in highdose group. graph b shows cd80 positive, 48.6% in pbs group, 63.2% in lowdose group and 76.7% in highdose group.
表1 elisa法检测细胞因子浓度（略）
tab.1 detection of cytokines concentration by elisa
note:mhsp60 group compared with control group,1) p＜0.01；lowdose group compared with highdose group,2) p＜0.01.
2.2 细胞表型检测 收集不同浓度mhsp60孵育的mdc及未加mhsp60的mdc，用流式细胞仪分析其表型cd11c+、cd80及cd86，结果显示：与对照组相比，处理组的cd80及cd86表达显著增高（p<0.01）。处理组内随mhsp60的浓度增加，cd80及cd86表达越明显，见图4。
2.3 同种混合淋巴反应 调节dc密度为5×104 ml-1时，dc刺激t淋巴细胞增殖的a值，高剂量组为6.3±2.9，低剂量组为3.8±1.6，显著高于对照组1.7±0.5(p<0.001)，说明hsp60dc刺激t淋巴细胞的能力明显增强；而高剂量组hsp60dc比低剂量组刺激能力更强(p<0.001)，说明hsp60dc刺激能力与mhsp60剂量呈正相关。
2.4 细胞因子检测 各悬液的细胞因子浓度见表1。处理组与对照组il4没有明显差别(p>0.05)；处理组的il12与ifnγ显著高于对照组（p<0.01），而高剂量组又较低剂量组浓度高（p<0.01）。il4/ifnγ比值处理组明显高于对照组(p<0.01)，而处理组内仍有差别（p<0.01），提示mhsp60使mdc刺激的免疫类型以细胞免疫为主，即产生免疫偏移。
3 讨论
动脉粥样硬化明确的病理过程尚不清楚，但目前认为其起始、发展与免疫炎症密切相关。树突状细胞作为体内最强的抗原提呈细胞，是免疫反应起始及发展的关键。初始t淋巴细胞必须与之接触后，通过mhc抗原的识别和cd80(b71)、cd86(b72)等共刺激分子的配对及某些细胞因子的作用才能激活，发挥生物学效应。我们以往证实动脉粥样硬化病人循环中dc的功能是增强的，且在体外应用不稳定型心绞痛一线药物阿托伐他汀后，dc的功能明显抑制［5，6］；而bobryshev等［7］亦发现了动脉粥样硬化斑块中存在dc及dc与t细胞接触的证据，肯定了dc参与动脉粥样硬化的发生及发展过程。
在动脉粥样硬化病理过程中dc所提呈的抗原目前认为有多种，如人巨细胞病毒、肺炎衣原体、oxldl（氧化型低密度脂蛋白）、hsp60等。而hsp60日益被重视，hsp60被认为是dc提呈的关键抗原之一。hsp是一类进化上高度保守的分子，细菌与人的hsp存在高度同源性。因而某些细菌感染后，dc细胞提呈细菌hsp65于t淋巴细胞所产生的抗体与人hsp60可能存在交叉反应，近年来这已在多种自身免疫疾病研究中得到证实［8］。同时研究表明病人血浆hsp60抗体滴度水平与冠心病发生存在相关性，血清抗分枝杆菌hsp65抗体在冠状动脉粥样硬化、血管炎、心肌缺血以及ptca术后狭窄患者中明显升高，且抗体水平升高可提示严重动脉粥样硬化的预后［3］。最近已有报道急性冠状动脉综合征病人的体内存在hsp60特异性t细胞，因而认为由于dc在细菌hsp65和人的hsp60之间存在交叉识别，某些细菌感染后dc摄取处理hsp65后呈递于初始t淋巴细胞，使之激活，而致敏t细胞通过交叉识别可能对自身血管内皮细胞产生免疫损伤，引起炎症反应，在动脉粥样硬化病人中则会引起粥样斑块增生和不稳定［9］。但是目前hsp60对dc的功能影响尚无报道，本研究在体外探讨了hsp60对dc的功能影响。
本研究中证实了hsp60在体外可以显著地提高dc免疫功能，表现在hsp60孵育后的dc共刺激分子cd86、cd80表达增加，抗原呈递功能增强，促使t淋巴细胞增殖及分泌细胞因子il12、ifnγ能力提高。值得注意的是，dc免疫功能的提高是hsp60剂量依赖性的。由于免疫过度激活是动脉粥样硬化启动因素，因而在斑块局部抑制hsp60/65激活dc，减少免疫炎性损伤，可能会起到抑制斑块增生和稳定斑块的作用，为预防或治疗动脉粥样硬化相关疾病提供新的思路。
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