作者：李静 檀卫平 吴葆菁 蓝丹 李文益 麦贤弟 范玲玲

【摘要】  【目的】 探讨白细胞介素-17(il-17)在中重度儿童哮喘发病、气道中性粒细胞炎症反应中的作用。【方法】 中重度持续哮喘发作期儿童45例，其中中度持续组(20例)与重度持续组(25例);以健康儿童20例为对照组。以酶联免疫吸附法(elisa)检测两组患儿外周血单个核细胞(pbmc)在cd3和cd28单克隆抗体刺激下分泌的il-17水平，检测诱导痰中性粒细胞数量;对以上病例进行联合治疗3个月后随访，达到临床缓解的病例20例纳入哮喘缓解组，复查其il-17水平。比较不同病情间il-17的表达水平，了解il-17与儿童哮喘临床病情、气道炎症反应的关系。【结果】 哮喘患儿pbmc表达il-17水平显著高于正常对照组(2 685 ± 1 081) pg/ml，其中哮喘发作组 (5 355 ± 813) pg/ml显著高于哮喘缓解组(4 504 ± 687) pg/ml (p均 < 0.05);重度持续组患儿pbmc表达il-17水平(5 830 ± 807) pg/ml显著高于中度持续组(4 962 ± 751) pg/ml (p < 0.05);急性发作期哮喘患儿il-17水平(5 355 ± 813) pg/ml与诱导痰中性粒细胞比例(xmin = 0， xmax = 98.8， m = 44.73)%、血中性粒细胞比例(51.72 ± 13.43) %成正相关(r = 0.820、0.736， p < 0.001)。www.11665.COm【结论】 中重度哮喘患儿外周血单个核细胞il-17表达水平升高，并与哮喘临床病情、气道炎症反应密切相关。

【关键词】  哮喘; il-17; 中性粒细胞

　　abstract： 【objective】 to investigate the effect of interleukin-17 (il-17) on the pathogenesis of moderate to severe children asthma and on the airway neutrophil inflammation reaction. 【methods】 forty-five patients (20 patients with moderate persistent asthma， 25 patients with severe persistent asthma)， as well as 20 normal control subjects， were included in this study. elisa was used to measure il-17 concentration in peripheral blood mononuclear cells (pbmc) from 65 children. pbmc were stimulated by anti-cd3 monoclonal antibody (okt3) (0.2 mg/l) and anti-cd28 monoclonal antibody (anti-cd28) (1 mg/l). the sputum specimens were assayed for cellular differential count. then the asthmatic children received combined treatment for 3 months， 20 cases were relieved， their il-17 concentration in pbmc were measured again. the correlation between the il-17 levels and the percentage of eosinophil， neutrophil in the induced sputum was analyzed. il-17 levels were compared between moderate persistent group and severe persistent group， between the acute group and the remission group. the relationship between il-17 and the disease severity and airway inflammation was analyzed. 【results】 the il-17 levels of asthmatic group were significantly higher than that of control group (2 685 ± 1 081) pg/ml， and the level of acute group (5 355 ± 813) pg/ml were also significantly higher than that of remission group (4 504 ± 687) pg/ml (p < 0.05). the il-17 levels of severe persistent group (5 830 ± 807) pg/ml were significantly higher than those of moderate persistent group (4 962 ± 751) pg/ml (p < 0.05). the il?鄄17 level (5 355 ± 支气管哮喘是由多种炎症细胞、细胞因子及炎症介质参与的气道慢性炎症性疾病。th1/th2平衡理论、嗜酸性粒细胞炎症学说的炎症机制已经广为接受。而近年研究显示中性粒细胞在哮喘，尤其是重型哮喘发病中起着重要的作用[1]。新发现的th17[2-3]通过分泌白细胞介素-17(interleukin-17，il-17)，可能介导中性粒细胞募集，参与哮喘的慢性气道炎症，并可能与气道重塑有关。有研究[4-7]显示il-17参与成人重度哮喘与激素抵抗型哮喘的发病，并有可能参与气道重塑的发生。但在儿童中重度哮喘中il-17的地位如何尚无报道。本实验拟结合临床哮喘患儿的临床病情及其血液、痰液标本中以上炎症细胞及因子的改变进行分析研究，从而了解il-17及中性粒细胞在中重度儿童哮喘中的作用，为探索哮喘的新治疗手段提供基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　中重度持续发作哮喘儿童45例(男27例，女18例)，其中中度持续组(20例)与重度持续组(25例)，平均年龄6.9(s = 2.4)岁。于其急性发作期取血及痰液标本，并行肺功能检测。经联合治疗后(治疗方案参照2007gina方案)病情缓解儿童20例，纳入缓解组研究对象(男13例，女7例)，平均年龄6.7(s = 2.3)岁。诊断、分级、分期标准参照中华医学会儿科分会2008年制定的儿童支气管哮喘防治常规[8]。剔除标准：①近2周口服或静脉使用过糖皮质激素或免疫调节剂;②第一次喘息发作;③哮喘合并其他免疫性疾病如结核病、系统性红斑狼疮、幼年类风湿性关节炎等;④心肺功能衰竭者。正常对照组：来自同期本院健康体检儿童共20例(男12例，女8例)，平均年龄5.9(s = 1.5)岁，对照组儿童无特应性疾病及免疫性疾病史。急性发作组、缓解组及对照组三组儿童性别(?字2 = 1.029，p > 0.05、年龄(f = 1.933，p > 0.05)经统计学处理差异无统计学意义，具有可比性。

　　1.2 主要试剂

　　淋巴细胞分离液购自达科为生物技术公司，pbs、rpmi1640培养液、二硫苏木糖醇(ddt)购自威佳公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，鼠抗人cd3单克隆抗体(okt3)、鼠抗人cd28 单克隆抗体(anti-cd28)购自bd/pharmingen公司，il-5、il-17 elisa试剂盒购自武汉中美科技有限公司。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 诱导痰的采集和处理

　　由喷射式雾化仪吸入3%高张盐水10 ～ 15 min，将咳出的痰液收集至约1 ml，取0.5 g左右黏稠痰液，加入适量的裂解液(0.1%dtt)，混匀后37 ℃水浴10 min并振荡10 min。将痰液用40 μm滤网过滤，1 500 × g离心10 min，细胞沉渣置于pbs中涂片，以甲醇固定，经white giemasa染色，如痰样镜检中鳞状上皮细胞占有核细胞比例 < 20%，则认为样本合格。计数200个非上皮细胞进行细胞分类，分类计算中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的百分比。

　　1.3.2 外周血单个核细胞(pbmc)的分离和培养

　　所有急性期患者于治疗前静脉采血2 ml，edta抗凝，pbs等体积稀释，缓慢加入淋巴细胞分离液上，1 500 × g离心20 min。吸取中间白膜层，以pbs充分洗涤2次，1 000 × g离心10 min，加入rpmi1640培养液重悬pbmc，调整细胞密度为1 × 109/l。将pbmc1 × 109细胞/l培养于96孔培养板中，加入anti-cd3(okt3) (0.2 mg/l) + anticd28(1 mg/l)共培养。培养板置于37 ℃，体积分数5%co2，饱和湿度培养箱中培养，72 h后收集上清存放至-80 ℃冰箱。

　　1.3.3 外周血单个核细胞(pbmc)培养上清il-17的测定

　　按照elisa试剂盒说明书测定pbmc培养上清il-17水平，单位为pg/ml。

　　1.3.4 血细胞形态的测定

　　血细胞形态：静脉采血1 ml涂片后，经he染色和white giemasa染色，分类计算中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的百分比并观察各细胞的形态。

　　1.4 统计学方法

　　实验数据采用spss 16.0统计软件进行数据整理和分析，符合正态分布连续性计量资料用均数符合正态分布连续性计量资料用均数 ± 标准差(x ± s)表示，两组均数比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用方差分析，采用配对样本t检验进行组间比较;非正态分布计量资料用全距(中位数)表示，双变量相关分析采取变量间spearman相关分析，检验水准α = 0.05。

　　2 结 果

　　2.1 哮喘患儿il-17水平的变化

　　体外与抗-cd3单克隆抗体与抗-cd28单克隆抗体共培养支气管哮喘患儿pbmc，产生的il-17水平，哮喘组显著高于正常对照组(2 685 ± 1 081)pg/ml，而哮喘急性发作组(5 355 ± 813) pg/ml又明显高于临床缓解组(4 504 ± 687) pg/ml，差异具有统计学意义(f = 52.387，p < 0.05)。在急性发作组中，重度持续组的il-17水平(5 830 ± 807) pg/ml显著高于中度持续组(4 962 ± 751) pg/ml，差异具有统计学意义(f = 0.954，p < 0.05)。

　　2.2 支气管哮喘患儿外周血、诱导痰中性粒细胞比例与il-17水平的关系

　　将急性发作期支气管哮喘患儿外周血、诱导痰中性粒细胞比例(%)分别与il-17水平(pg/ml)进行相关分析，发现哮喘患儿外周血中性粒细胞比例(51.72 ± 13.43)%、诱导痰中性粒细胞比例(xmin = 0， xmax = 98.8， m = 44.73)%与il-17水平(5 355 ± 813) pg/ml成正相关，rp分别为0.736、0.820，p < 0.001 (图1) 。

　　3 讨 论

　　支气管哮喘是一个慢性气道炎症伴气道重塑的过程，涉及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞等。目前的th1/th2平衡理论及嗜酸性粒细胞炎症学说并不能完全解释哮喘的发病过程。有学者将哮喘按不同的炎症机制分为非嗜酸细胞型及嗜酸细胞型[9]。研究非嗜酸细胞型哮喘通过il-17驱动的中性粒细胞炎症机制对发展新的治疗措施有重要的意义。目前研究[1，10]提示难治性哮喘、哮喘持续状态、吸入激素过快减量等病人诱导痰中性粒细胞明显增高，肯定了中性粒细胞在难治性哮喘中的作用，但中性粒细胞和il-17在儿童中重度哮喘的具体作用未明。

　　本研究发现哮喘病人的il-17水平显著高于正常对照者，急性发作组的中性粒细胞比例及il-17水平明显高于缓解组，外周血、诱导痰中性粒细胞比例与il-17水平成显著正相关，表明il-17及中性粒细胞在哮喘的急性发作、加重中起着重要作用，il-17与哮喘炎症中性粒细胞活化、趋化过程密切相关[11]。

　　bullens等[12]发现中重度持续哮喘病人诱导痰中il-17mrna与cd3γmrna以及痰中性粒细胞计数成正相关，中重度持续的哮喘病人中均可发现高il-17amrna水平表达，但并未对两组不同病情的il-17amrna水平进行比较。我们对急性发作组病人不同病情(中度持续组与重度持续组)间il-17水平进行了比较，发现重度持续组的il-17水平显著高于中度持续组，提示相对高的il-17可驱动更严重的中性粒细胞炎症反应。

　　综上所述，支气管哮喘的慢性炎症过程中，中性粒细胞发挥了重要作用，其活化体系中的炎症因子及细胞因子形成复杂的网络结构，进一步研究这些炎症细胞及其活化过程中的细胞因子的相互关系有助于探索新的哮喘治疗手段，以更好地控制儿童支气管哮喘的发生发展。

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