[摘要] 目的：探讨利用基于lc-ms技术的代谢组学方法诊断肝癌的可行性。方法：采用反向液相色谱-电喷雾质谱（rp-lc/esi-ms）检测肝细胞癌(简称肝癌)患者和健康人血清中代谢物，利用主成分分析(principle component analysis, pca)对ms数据进行模式识别。结果：与健康人相比，肝癌患者血清中牛磺酸和组氨酸含量减少，苯丙氨酸、酪氨酸含量增加。pca分析结果显示肝癌患者可与健康人鉴别开来。结论：lc-ms代谢组学技术结合pca的方法具有灵敏、准确、重复性好等优点，有助于肝癌早期诊断。
　　[关键词] 肝细胞癌；血清；代谢物组；lc-ms；主成分分析；模式识别
　　[中图分类号] r735.7 [文献标识码] c[文章编号] 1674-4721（2011）06（a）-085-02
　　
　　目前，临床上诊断肝癌的主要方法为病理、影像和血清afp检查。这些检测手段中，病理法属于有创性检查，对患者造成组织损伤，不能作为常规检查方法；b超、ct、磁共振成像对小肝癌灶检出率较低；血清afp检查诊断肝癌灵敏度低，因此，建立一种无损、准确、灵敏的肝癌诊断方法具有重要的临床价值。代谢组学是一种通过考察生物体系受刺激或扰动后代谢产物随时间的变化，并以此来研究生物体系代谢途径的新技术[1-2]。代谢组学作为新兴的学科，已成功应用于疾病诊断、药物作用模型的鉴别和确证、药物作用机制研究等领域[3-6]。目前代谢组学分析中常用的两种检测手段是核磁共振（nmr）技术和质谱（ms）及其联用技术。wWw.11665.COM相比于nmr灵敏度低、检测动态范围窄等弱点，现代ms技术的优势是具有很高的灵敏度和专属性，可以实现对多个化合物的同时快速分析与鉴定，现已成为生物分析中的首选方法。本研究采用lc-ms法检测肝癌患者和健康人血清中代谢物，比较分析两组血清代谢物组的差异，同时利用pca对ms数据进行模式识别，以期建立肝癌的诊断模型。
　　1 仪器与试剂
　　1.1 仪器
　　agilent 1100型高效液相色谱仪，agilent lc/msd trap xct plus 型质谱仪、高压二元梯度泵、二极管检测器、自动进样器、柱温箱、chemstations化学工作站等（美国agilent公司），日立20pr-52d型高速冷冻离心机，电热真空干燥箱（上海申光仪器仪表有限公司），kq- 250 de型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），milli-q纯化水制备系统(millipore公司)。甲醇、乙腈均为色谱纯（美国fisher公司）。
　　1.2 样品的采集
　　分别采集30份男性肝癌患者以及30份健康男性 （无相关病史的健康人群)受试者静脉血5 ml 至促凝管中，室温下静置1 h后在4℃、13 000 g离心10 min），置-80℃贮存备用。采血前禁食12 h。肝癌诊断标准按照2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会修订的肝癌临床诊断标准[8]，上清液lc-msn分析。
　　1.3 lc-ms 条件
　　反向液相色谱（rp-lc），色谱柱：prevail c18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相a：10mm甲酸铵缓冲液（甲酸调ph 4.0）；b：0.1%甲酸乙腈，a与b梯度洗脱：0～5 min，b%10～30，5～9 min，b% 30～60，9～20 min，b%60～70，20～25 min，b%70～100；柱温：25°c；流速：0.8 ml/min；质谱条件：esi离子源，离子源温度350℃，毛细管电压3.5 kv，雾化压力285.8 kpa，雾化压力60.0 psi，干燥气流速11.0 l/min，质谱扫描范围75～800 m/z，正离子检出模式。
　　2 结果
　　2.1 血清样品检测总离子流图
　　按照以上实验方法，对血清样本进行了分析测定，图1中a、b分别是健康人和肝癌患者血清典型的lc-ms总离子流谱，图中可见，正常人血清样本的总离子流图与肝癌患者血清样本的总离子流图有明显区别。
　　a为健康人血清；b为肝癌患者血清
　　

　　2.2 肝癌的生物标记物
　　通过lc-ms检测，与正常人相比，肝癌患者血清中牛磺酸和组氨酸含量减少，而苯丙氨酸、酪氨酸含量增加。牛磺酸是重要的抗氧化物质，曾有研究报道，其在肝硬化患者血清中含量增加，而肝癌患者血清中牛磺酸含量没有改变[7]，但笔者研究发现牛磺酸在肝癌患者血清中含量减少，推测牛磺酸的含量与肝癌病情程度有关，需要进一步研究。
　　2.3 模式识别分析
　　利用pca对正常人和肝癌患者两组血清lc-ms数据进行模式识别分析，得到相应血清标本的pca得分图（3d pca scores plot)。得分图中每一个点代表了一个标本，见图2。从图2中可以直观地看出各血清标本在空间上的位置以及相互聚合程度，图2中肝癌和健康人标本显著分离，说明两者血清代谢物组确实存在显著差异。
　　3 讨论
　　为了探讨利用代谢组学技术结合模式识别分析诊断肝癌的可行性，对肝癌患者血清lc-ms数据进行pca分析。结果表明肝癌患者可与健康人标本100%区分开来，利用基于lc-ms代谢组学技术结合pca的模式识别方法诊断肝癌诊断结果可靠。有利于临床早期诊断、早期治疗肝癌。此外,由于代谢组学反应的是基因和蛋白表达终端的变化、是对基因组学和蛋白组学在代谢物研究上的放大，因此利用此技术诊断疾病更灵敏、快速。
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