摘要：采用纯培养的方法，从美国内达华州温泉和中国福建永泰温泉分离得到27株嗜热细菌，从中筛选得到产纤维素酶的嗜热细菌并进行了16s rdna鉴定。结果表明，ly7和ly8是产纤维素酶的嗜热细菌，菌株ly7与脂环酸芽孢杆菌属（alicyclobacillus）的同源性达到99%，菌株ly8与土芽孢杆菌属（geobacillus）的同源性达到99%，生长温度范围在40～70 °c之间，最适温度65 °c。酶学性质分析表明，ly8的内切酶酶活高达145 iu/ml。
　　关键词：温泉；嗜热细菌；热稳定纤维素酶；分离；鉴定
　　中图分类号：q939.9；q93-331 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2014）07-1516-04
　　isolation and identification of thermophiles degrading cellulose in hot spring
　　mei fan1a，1b，lin bai-xue1a，zhao chao1a，1b，liu bin1a，1b，2
　　（1a.college of food science；1b.institute of bioenergy， fujian agriculture and forestry university， fuzhou 350002， china；
　　2.china national engineering research center of juncao technology， fuzhou 350002， china）
　　abstract： culture-based approach was used to isolate thermophiles from hot spring. in total， 27 thermophilic bacterial strains were isolated from hot springs in nevada of usa and yongtai hot spring in fujian province of china. superior cellulose and hemicellulose decomposing strains were screened and identified by 16s rdna. the results showed that ly7 and ly8 degrading cellulose were indentified as alicyclobacillus sp. ly7 and geobacillus sp. ly8. geobacillus sp. ly8 could be cultured at temperature ranging from 40 ℃ to 70 ℃， with the optimal temperature of 65 ℃. the β-glucosidase activity of ly8 was 145 iu/ml.
　　key words： hot spring； thermophiles； thermostable cellulase； separation； identification
　　纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称。WWw.11665.cOm根据酶的功能差异分为三类：①内切葡聚糖酶（ec 3.2.1.4）；②外切葡聚糖酶（ec 3.2.1.91）；③β-葡萄糖苷酶（ec 3.2.1.21）[1，2]。纤维素酶降解纤维素是酶系各组分之间协同作用的结果。首先由内切葡聚糖酶在纤维素分子内部非结晶区进行随机的酶切产生小分子的纤维素，然后由外切葡聚糖酶以纤维二糖为单位从纤维素线性末端进行水解，每次切下一个纤维二糖分子，最后由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖以及短链纤维寡糖水解成葡萄糖[3-5]。
　　嗜热菌是一类能在45 ℃以上生长和繁殖的极端环境微生物，包括部分细菌、古菌和真菌三大类，通常分布在地热环境和人工高温环境中，如温泉、地热区土壤、深海火山口、深海热液区以及高温堆肥、热水器等环境[6]。嗜热菌产生的热稳定酶具有耐热性、高效性以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，在食品、医药、生物质能源、生物工程及废物处理等方面都得到广泛的应用[7]。其中，热稳定的纤维素酶在纤维素的转化中有着重要的应用价值。研究表明，许多高温菌具有分解纤维素的能力，如芽孢杆菌属（bacillus）、梭状芽孢杆菌属（clostridium）、脱硫肠状菌属（desulfotomaculum）、热酸杆菌属的解纤维素热酸杆菌（acidothermus cellulolyticus）、喜热菌属（caloramator）的厌氧和分解纤维素高温菌na10菌株[8]。由于高温有利于纤维素的降解，而高活力热稳定的纤维素酶更是纤维素酶研究的重要内容。因此，研究采用纯培养的方法从温泉样品中筛选出能降解纤维素的耐热性菌株并进行了16s rdna鉴定，为在常温条件下获得有价值的热稳定性强的酶奠定了基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　温泉样品：大盆地温泉和大沸泉，温度42.5～97.0 ℃，取自美国内达华州；42～70 ℃温泉样品，取自福建福州永泰。菌株escherichia coli dh5α为福建农林大学食品科学学院实验室保存。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 嗜热细菌的分离 将泥样和水样混合均匀后，以500 r/min离心2 min，去除大颗粒的杂质，然后以10 000 r/min离心10 min，获得菌体沉淀。水样可以直接利用。处理后的样品分别置于4 ℃冰箱和-70 ℃超低温冰箱。取处理好的样品加适量无菌生理盐水稀释，取1

00 μl涂布于zobell 2216e或者tim改良后的tm固体培养基上，置于不同温度的电热恒温鼓风干燥箱中培养。挑取单个菌落进行划线分离，反复分离至单一菌落。 　1.2.2 嗜热菌全菌蛋白分析 将提取纯化得到的嗜热菌全菌蛋白进行sds-page凝胶电泳，挑选具有不同电泳带型的嗜热菌菌株进行复筛。
　　1.2.3 降解纤维素嗜热菌的筛选 将纯化得到的嗜热菌分别点种于纤维素筛选平板上，置于合适的温度下培养1～2 d。用0.1%刚果红染色0.5 h，再用1 mol/l nacl溶液脱色0.5 h，挑选有透明圈的菌落，测量透明圈直径，进行初筛。复筛采用液体发酵培养基，于120 r/min下培养36 h，测定发酵液酶活[9，10]。
　　1.2.4 16s rdna基因序列的pcr扩增和鉴定 用细菌基因组提取试剂盒提取嗜热菌基因组dna，再进行pcr扩增，将回收后的16s rdna片段与pmd18-t vector 在16 ℃连接过夜，再转化至e. coli dh5α中。将提取得到的质粒经hind ⅲ限制性内切酶和bamh i限制性内切酶在37 ℃反应3～4 h，取适量酶切产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，分析插入片段的大小，确定克隆是否成功[11]。
　　1.2.5 序列比对和系统发育分析 阳性克隆的测序由北京天根生物科技公司完成。核酸序列相似性分析采用美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information， ncbi）提供的比对搜索工具blast（basic local alignment search tool， blast）进行搜索（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。用clustal x（1.83）进行序列比对，采用mega构建系统发育树。
　　2 结果与分析
　　2.1 嗜热菌的分离纯化和菌株分型
　　每个样品经过处理后，涂布于嗜热菌分离培养基zobell 2216e或者tim改良后的tm固体培养基上，分别在53 、60 、65 、70 、85 ℃下进行培养。经过多次划线分离纯化得到27株嗜热菌菌株。
　　部分嗜热菌的菌落形态如表1所示。已纯化的嗜热细菌菌株采用甘油法保存于-70 ℃冰箱。
　　采用嗜热菌全菌蛋白的sds-page凝胶电泳（图1）对27株嗜热菌进行初步筛选。挑选具有不同电泳带型的嗜热菌菌株进行下一步的研究。
　　2.2 降解纤维素嗜热菌的筛选与鉴定
　　2.2.1 产纤维素酶嗜热菌的筛选 采用刚果红染色法从永泰温泉筛选到两株具有较强纤维素降解能力的菌株ly8和ly7，对这两株菌株的形态进行观察，并进行鉴定。
　　2.2.2 产纤维素酶嗜热菌的形态特征 两株菌株都是杆状、有芽孢的革兰氏阳性菌，菌落均是白色。ly7没有鞭毛，ly8有鞭毛（表2）。
　　2.2.3 降解纤维素嗜热菌的酶活活性 纤维素酶根据酶的功能的差异可分为三类：内切葡聚糖酶（eg），外切葡聚糖酶（cbh），β-葡萄糖苷酶（bgl）。如图2所示，ly8内切葡聚糖酶活性高达145 iu/ml。
　　2.3 降解纤维素嗜热菌的鉴定
　　2.3.1 产纤维素酶嗜热菌的16s rdna鉴定 将ly7和ly8接种液体培养基，65 ℃培养36 h后离心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取这两株嗜热菌的基因组dna。用细菌通用引物euba27f和euba1492r进行16s rdna 的扩增，扩增产物大小约1 500 bp，结果见图3。
　　将纯化回收的16s rdna pcr产物与pmd 18-t 载体连接，转化e. coli dh5α，双酶切验证后（图4）送北京天根生物科技公司测序。
　　2.3.2 序列比对与系统发育分析 ly7和ly8的16s rdna测序结果表明，菌株ly7的16s rdna为1 531 bp，菌株ly8的16s rdna为1 552 bp。用blast在ncbi中搜索同源序列进行比较分析，结果（图5）显示，菌株ly7属于脂环酸芽孢杆菌属（alicyclobacillus），菌株ly8属于土芽孢杆菌属（geobacillus），生长温度为40～70 ℃，最适温度65 ℃。
　　3 小结与讨论
　　本研究以纤维素为底物，从美国内达华州温泉和中国福建永泰温泉分离得到两株产纤维素酶的嗜热细菌菌株ly7和ly8，它们的最适反应温度为65 ℃，而目前文献中报道的纤维素降解菌株最适温度为30 ℃左右，因此本研究筛选的菌株可在很多工业和生物技术领域得到广泛应用。嗜热细菌ly8的酶活最高，其内切葡聚糖酶活性最高达145 iu/ml，与文献报道的产内切葡聚糖酶活性较高的几株菌株（绿色木霉c-08最高酶活为89 iu/ml[12]、里氏木霉40359最高酶活100 iu/ml[13]）相比，可知嗜热细菌ly8内切酶活性最高。虽然目前工业上纤维素酶产生菌trichoderma reesei工程菌mcg80发酵酶活为300～500 iu/ml[14]，但嗜热细菌ly8

为一株野生菌株，酶活能够达到这个水平，说明很有应用前景，如果再通过诱变育种很可能成为一个生产菌株，而且其可在高温范围降解纤维素，有着常温细菌不可比拟的优势。通过16s rdna序列鉴定，ly8属于土芽孢杆菌属（geobacillus），ly7属于脂环酸芽孢杆菌属（alicyclobacillus）。由于真菌降解纤维物质主要是通过分泌大量的胞外酶来进行的，因此纤维素降解真菌在纤维素酶的开发和应用上具有细菌、放线菌等所不具有的优势。然而，本研究的细菌体内存在着独特的耐高温代谢途径和耐高温酶，如果通过分子生物学方法克隆这些耐高温酶的基因，并使其在毕赤酵母等真菌宿主中进行表达，就可以在常温条件下获得有价值的热稳定性强的酶，因此具有极高的研究和应用价值。
　　参考文献：
　　[1] percival zhang y h， himmel m e， mielenz j r.outlook for cellulase improvement： screening and selection strategies[j]. biotechnology advances，2006，24（5）：452-481. [2] zhang z s，donaldson a a，ma x x.advancements and future directions in enzyme technology for biomass conversion[j]. biotechnology advances，2012，30（4）：913-919.
　　[3] 贾新成，陈红歌.酶制剂工艺学[m].北京：化学工业出版社，2008.
　　[4] olsson l.生物燃料[m].曲音波，译.北京：化学工业出版社，2009.
　　[5] 于海玲，李树伟，王华明.葡萄穗霉中β-葡萄糖苷酶的基因克隆、表达及酶学性质分析[j].生物技术通报，2013（6）：128-132.
　　[6] rothschild l j， mancinelli r l.life in extreme environments[j]. nature，2001，409：1092-1101.
　　[7] shafiei m，karimi k， taherzadeh m j.pretreatment of spruce and oak by n-methylmorpholine-n-oxide（nmmo） for efficient conversion of their cellulose to ethanol[j]. bioresour technol，2010，101（13）：4-8.
　　[8] 伯 阳.纤维素乙醇技术发展趋势[j].精细化工原料及中间体， 2009（2）：16-20.
　　[9] 胡国全，邓 宇，徐 恒，等.极端嗜热厌氧纤维素菌的分离鉴定、系统发育分析及其酶学性质的研究[j].应用与环境生物学报，2004，10（2）：197-201.
　　[10] 丛峰松.生物化学实验[m].上海：上海交通大学出版社，2005.
　　[11] 罗 颖，欧阳嘉，许 婧，等.耐热纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及产酶条件优化[j].食品与生物技术学报，2007，26（1）：84-89.
　　[12] 白洪志，杨 谦，宋金柱，等.纤维素降解菌绿色木霉c-08产酶条件研究[j].哈尔滨工业大学学报，2008，40（7）：1111-1115.
　　[13] 张晓炬，李景富，王傲雪.里氏木霉产纤维素酶条件的优化[j].东北农业大学学报，2008，39（7）：29-33.
　　[14] 顾方媛，陈朝银，石家骥，等.纤维素酶的研究进展与发展趋势[j].微生物学杂志，2008，28（1）：83-87.