原文作者：周黎，张炳坤，冶海林
摘要：2010-2012年从新疆昌吉地区西甜瓜主要种植区采集细菌性果腐病的病样，从其病叶、病果和种子上分离纯化得到了6个细菌菌株。通过对西、甜瓜上分离的病原细菌进行形态观察、染色试验、致病性测定、生理生化性状等常规细菌鉴定，得出导致瓜类细菌性果腐病发生的病原菌是燕麦嗜酸菌西瓜亚种（acidovorax avenae subsp. citrulli. willems et al.）。
关键词：瓜类细菌性果腐病；鉴定；病原
瓜类细菌性果腐病，又叫果斑病，是为害西甜瓜的一种危险性病害。该病害2007年被中国重新列为《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中重大对内对外检疫性植物病害。该病害除了为害幼苗、叶片以外，主要为害果实，一旦发病用药防治基本没有效果，而且会导致种子带菌，成为下一年主要的初侵染源[1]。近些年来，美国、日本等国在新疆的瓜类制种业务十分频繁，每年从美国进口的西瓜种子批次及品种数量多、种植面积大，为该病的发生和传播创造了条件[2]。2010-2011年，笔者对北疆地区昌吉市、奇台县、五家渠市、阜康市、吉木萨尔县等主要西甜瓜种植区进行了病害普查，发现该病的发生率达到60%以上，有的地块甚至100%，毁田绝收。发现该病在作物幼苗期就可发病，首先在西瓜、甜瓜真叶叶面上出现直径l.2 mm水渍状小斑点，扩展形成呈多角形、圆形、条形或不规则形暗绿色大病斑，叶边缘为“v”字型病斑，湿度大时，病斑上溢出白色菌脓。www.11665.CoM果实发病，首先在果实上表皮出现水浸状小斑点，逐渐变褐，稍凹陷，后期受感染的果皮经常会龟裂。随着病情的发生，病原菌会蔓延到果肉，呈水浸状腐烂。查阅相关资料，并采集病样请专家鉴定，均认为该病害为瓜类果腐病疑似病例。为了准确诊断和明确其病原菌的分类地位，为生产上提供切实可行的防治依据，笔者对此病害进行了详细的鉴定。
1 材料和方法
1.1 菌株的采集和分离
1.1.1 病叶、病果的采集与分离
在西甜瓜各主要种植区采集具有典型症状的病叶、病果，用平板划线法分离[2]，具体方法为：切取病健交界的部位用75%的酒精表面消毒30 s，无菌水冲洗后置于研钵中研磨，蘸取该组织液在kb培养基上划线培养，待有单个菌落长出即转管，并于4 ℃冰箱中保存备用。
1.1.2 病样种子的采集与分离
选取具有典型症状的病瓜，把其种子用无菌水冲洗3次，然后将种子在无菌水中浸泡30 min，用灭菌的接种环蘸取浸泡液在kb培养基平板表面划线，翻转培养皿，放在28 ℃恒温箱中培养。
种内分离时将种子在5%次氯酸钠中浸泡3 min，然后用无菌水冲洗3次，用灭菌的手术刀将种子剪开，弃去种壳，将种仁研碎加入适量无菌水静置30 min，方法同上，观察菌丝生长情况。
1.1.3 所用培养基
kb培养基，按方中达《植病研究方法》[3]中提供的方法配制。 [论文网]
1.2 病原菌的鉴定
1.2.1 致病性测定
用无菌水配制1×108cfu/ml细菌悬浮液，用于接种西瓜、甜瓜幼苗和果实。接种方法：喷雾接种到健康的西瓜、甜瓜幼苗叶片上，30 ℃条件下塑料薄膜保湿48 h，2 d后观察症状，以不接菌作对照；果实接种采用针刺法接种到健康瓜上，30 ℃条件下保湿48 h，2 d后观察发病症状，调查发病情况，观察并记录结果，以针刺法接种无菌水作为对照。
1.2.2 培养性状观察
在kb培养基上培养48 h后，观察供试菌落形态、大小，并在紫外灯下观察是否产生荧光。
1.2.3 病原菌落的形态观察
将供试菌株在27 ℃下培养16 h，用磷钨酸（pta）负染，然后在gem-1200ex电镜下放大10 000倍观察其菌体形态、鞭毛数目及其着生位置。
1.2.4 革兰氏染色
用牙签挑取菌落放在载玻片上与3%氢氧化钾液滴搅拌1～2 min，然后慢慢地拉出看有无黏丝出现。革兰氏阴性菌的细胞壁易被碱液溶解而拉出丝状物，革兰氏阳性菌则不被溶解而无丝状物出现。
1.2.5 病原菌的生理生化性状测定
根据致病性、培养性状及菌落形态的一致性，选取2个代表性菌株做生理生化测定，所采用的病原菌均为kb培养基上培养24～48 h的新鲜菌种，每个菌株的测定项目至少重复3次。主要指标测定方法参照《植病研究方法》[3]。
2 结果与分析
2.1 病原细菌的分离结果
从新疆昌吉地区10个西甜瓜主要种植区，采集到典型病样36个，采用平板划线分离法从不同部位的病株、病果和种子上进行分离，共获得53个分离物，纯化后镜检，按菌株类型和培养特性进行初步分类，分离结果表明主要是角斑病和果腐病[4，5]。经纯化后，获得6种果腐病菌株，分离结果可见表1。
2.2 病原细菌的致病性鉴定结果
将6个代表性菌株接种西甜瓜，对照不发病。6个菌株均表现出与田间相同的症状。最初的症状是子叶背面沿叶脉呈现暗水渍状病斑，有时在下胚轴也会出现这种病斑，严重时幼苗塌陷、死苗。随着幼苗的生长，真叶上的病斑变成黑褐色并卷缩萎蔫，十分明显。在果实成熟前后2周，初期果实表面出现直径小于2 cm的无规律性水浸状斑点，当天气阴暗、空气湿度较大时，果实表面水浸状小点3～5 d内变成黄褐色，病斑扩大，变成更大且边缘不规则的水渍状病斑。但严重时病斑会变成棕褐色，果实表面开裂，并出现白色泡沫状分泌物，果实逐渐腐烂（见图1和图2）。经柯赫氏法则验证，这6个菌株均为该病的病原菌。
2.3 病原菌鉴定结果
2.3.1 培养性状
形成乳白色圆形菌落，光滑，中间稍隆起，边缘整齐，大小为l.2 mm。培养48 h后形成丝状菌苔，表面光滑，半透明，无黏性，培养基不变色。
2.3.2 病原细菌的形态
革兰氏染色反应为阴性，菌体短杆状，两端钝圆，极生1根鞭毛。见图3。
2.3.3 病原菌的生理生化性状
由表2可知，供试菌株zlb02和zlb06的氧化酶和过氧化氢酶反应均为阳性。在kb培养基上不产生荧光色素，ydc培养基上菌落颜色为白色，41 ℃条件下能够生长，耐盐性为3%，石蕊牛乳产碱、胨化，甲基红反应和phb颗粒均为阴性，不产生吲哚。不引起马铃薯薯条软腐，不能液化明胶，可水解吐温80，不能水解淀粉。根据上述特性，依照《伯杰细菌鉴定手册》[5]，将6种致病菌株确定为燕麦嗜酸菌西瓜亚种（acidovorax avenae subsp. citrulli. willems at al.）。
3 结论与讨论
3.1 经对昌吉市、奇台县、五家渠市、阜康市、吉木萨尔县等西甜瓜主要种植区采集分离获得的瓜类细菌性果腐病菌株进行致病性测定、革兰氏染色、菌体形态和培养性状观察及部分生理生化测定，查明采集菌株与金岩等[6-9]报道的燕麦嗜酸菌西瓜亚种性状相一致，因此将其鉴定为燕麦嗜酸菌西瓜亚种。
3.2 对北疆地区主要西甜瓜生产基地进行了瓜类细菌性果腐病调查，发现在连年种植的老制种基地，该病害发病重、发病早，新制种基地发病轻。西瓜甜瓜都可以发病，病害除了侵染植株以外，还可以为害果实。甜瓜比西瓜受害重[10]。在田间调查时，西瓜品种尤其是毋叉瓜发病重，重病田发病率达到75%以上，甜瓜金皇后系列发病率达到80%以上。
3.3 在病害分离时，西瓜、甜瓜植株和果实上均可以分离到细菌性果腐病病原菌，经过致病性测定，均有致病能力；种子分离时种子表面能分离到病原菌，种内没有分离到病原菌，说明病原菌多聚集在种壳上。任毓忠等[11]利用pcr对病瓜种子不同部位的带菌量进行了分析，同样认为带菌部位主要集中在种子表面，种子内部和种仁的带菌量较小。这可能是因为果实被病原菌侵染发病腐烂后，烂果组织里的病原菌附着在种子表面，腐烂组织与种仁无法直接接触，所以感染的几率很低，带菌量较小。
参考文献
[1] 李鹏.瓜类细菌性果腐病病原菌鉴定和生物学特性的研究[d].福州：福建农林大学，2004：1-4.
[2] 林德佩.瓜类作物细菌性果实腐斑病（bfb）防治研究概述[j].中国瓜菜，2005（4）：35-37.
[3] 方中达.植病研究方法[m].3版.北京：中国农业出版社，1998.
[4] 任欣正.植物病原细菌的分类和鉴定[m].北京：中国农业出版社，1994.
[5] buchanan r e， gibbons n e. bergey's manual of determinative bacteriology[m]. 8th edition. baltimore： the williams and wilkins co.，1974.
[6] 金岩，张俊杰，吴燕华，等.西瓜细菌性果斑病的发生与病原菌鉴定[j].吉林农业大学学报，2004，26（3）：263-266.
[7] 薛莉，杨成德，陈秀蓉，等.甘肃省西瓜细菌性果斑病的诊断[j].植物保护，2009，35（2）：53-57.
[8]王晓东，孙玉宏，葛米红，等.武汉地区保护地甜瓜细菌性斑点病病原鉴定[j].湖北农业科学，2010，49（8）：1883-1886.
[9] 任小平，李小妮，王琳，等.广东西瓜果斑病的病原鉴定[j].华南农业大学学报，2010，31（4）：40-43.
[10]赵延昌，孙福在，王兵万，等.哈密瓜细菌性果斑病病原菌鉴定[j].植物病理学报，2001，31（4）：357-364.
[11]任毓忠，李晖，李国英，等.哈密瓜细菌性果斑病种子带菌的pcr检测[j].新疆农业科学，2004，41（5）：329-332.
