4种养殖鱼类溶菌酶活性比较研究
溶菌酶(lysozyme)广泛存在于水生动物的血清、皮肤粘液和组织器官当中,其代表的非特异性免疫水平比哺乳动物更重要，因为低等水生动物的特异性免疫系统还不很完善，比高等脊椎动物更依赖于非特异性免疫 [1]。
近几十年来，人们已经分别对草鱼、鲢、鳙、团头鲂、暗纹东方鲀、日本鳗鲡、大西洋鲑、牙鲆、香鱼、真鲷等水产动物的溶菌酶活性进行了研究，并认为性别、鱼体规格、季节、遗传、温度、食性和健康状况等诸多因素对鱼体溶菌酶水平有影响[2-6]。本试验以澳洲银鲈、鲫鱼、黄颡和黄鳝为研究对象，对其不同组织的溶菌酶活性进行测定和比较，以期了解溶菌酶在这4种养殖鱼类中不同组织内的分布,进一步丰富水产动物溶菌酶的基础资料，并为该鱼类的养殖、疾病诊断和预防提供参考。
1 材料和方法
1.1 试验材料 本文由论文联盟http://收集整理
1.2 试验方法
1.2.1 酶粗提液制备 用5 ml注射器从鱼尾的动（静）脉取血(黄鳝采用断尾取血)放入离心管中。用蒸馏水轻轻冲洗鱼体后,再用干净的载玻片将体表黏液轻轻刮下放入匀浆器里。解剖鱼类，取出一定量的组织，精确称质量，放入匀浆器里（匀浆器置于装有冰块的烧杯里），根据组织的质量加入一定比例的蒸馏水，将组织碾磨成组织液。所有样本均置于4 ℃冰箱里抽提8～12 h。取出样本，用tgl-16g-a冷冻离心机离心10 min（4 ℃，4 000 r·min-1），上清液即为酶粗提液，保存酶粗提液于4 ℃冰箱中待用。wwW.11665.com
1.2.2 溶壁微球菌悬液制备 用常规固体培养基扩大培养溶壁微球菌（琼脂10 g，牛肉膏2.5 g，葡萄糖0.5 g，氯化钠2.5 g，蛋白胨5 g, 蒸馏水500 ml）。收集培养的溶壁微球菌于匀浆器中，加入5 ml的磷酸缓冲液（0.067 mol·l-1，ph 值6.26），缓慢上下旋转碾磨1～2 min，尽量使固-液相分布体系均匀稳定，转入容量瓶中，再加入30～40 ml的磷酸缓冲液，摇匀，使其a450在0.85左右,置于4 ℃冰箱中保存备用。
1.2.3 溶菌酶活力测定 溶菌酶活力测定见参考文献[7]。酶活性定义为在28 ℃，ph值为6.26条件下每克组织每分钟使a450下降0.001为1个活力单位。
2 结果与分析
2.1 4种鱼类不同组织溶菌酶活性
4种鱼类不同组织溶菌酶活性见表2。从表2可以看出，有鳞澳洲银鲈和鲫鱼不同组织溶菌酶活性的大小次序均为：肾脏>血清>肠粘膜>脾脏>鳃，且肾脏溶菌酶活性远远高于其它组织；澳洲银鲈除血清和肠粘膜间外，其余组织间皆差异显著(p<0.05)；鲫鱼血清和肠粘膜、脾脏和鳃间没有显著差异(p>0.05)，其余组织间皆差异显著(p<0.05)，且两种鱼肾脏与其它组织间差异极显著(p<0.01)；无鳞黄颡和黄鳝组织中溶菌酶活性的大小次序均为：肾脏>脾脏>肠粘膜>血清>鳃>体表黏液，不仅肾脏里的溶菌酶活性极显著地高于其它组织(p<0.01)，脾脏里的溶菌酶活性也显著地高于肠粘膜、血清和鳃(p<0.05)，但体表粘液里几乎检测不到溶菌酶活性。
2.2 不同鱼类同种组织溶菌酶活性
将不同鱼类同种组织溶菌酶活性进行方差分析并进行比较，结果见表2。从表2可以看出, 4种鱼类中相同组织溶菌酶活性，无鳞的黄鳝和黄颡鱼溶菌酶活性在所检测的组织中均接近或显著地高于有鳞的鲫鱼和澳洲银鲈(p<0.05)，但其体表黏液的溶菌酶活性均低；鲫鱼和澳洲银鲈间除肾脏外，其它组织间差异不显著(p>0.05)。
3 讨 论
鱼体中溶菌酶的产生与哺乳动物相似,主要由嗜中性粒细胞和单核细胞产生,少量由巨噬细胞生成，而鱼类血液、肝、脾脏、肾脏、肠粘膜等组织和器官中含有丰富的血细胞, 这些血细胞一方面能分泌溶菌酶进入这些组织中，另一方面，血液在鱼体中各部位的循环流动能够使溶菌酶分布得更加广泛,使那些自身不能产生血细胞的组织同样可以含有溶菌酶[8]。本试验结果也表明，在水产动物的肾脏、血清、脾脏、肠粘膜、鳃、体表黏液等组织都或多或少地能检测到溶菌酶活性。因此,从非特异性免疫角度而言,鱼类溶菌
酶在鱼类疾病防御中行使着广泛而全面的非特异性免疫功能。然而，从表2可以看出，本试验所检测的鱼类中肾脏的溶菌酶活性显著地高于其它器官和组织，可能是由于肾脏是白血球的主要生成器官的缘故,而鱼类溶菌酶主要是由嗜中性白细胞和单核细胞等白细胞产生所致[8]。鲟鱼和假雄牙鲆脾脏中虽存在溶菌酶，但活性远远低于肾脏[6,9]；在大西洋盲鳗和鳕鱼的脾脏中甚至没有检测到溶菌酶活性[10]。本试验在有鳞的澳洲银鲈，鲫鱼的脾脏中虽检测到溶菌酶的活性，但远远低于肾脏，而在无鳞鱼黄鳝和黄颡脾脏中虽检测到了高活性的溶菌酶的活性，也同样远远低于同种鱼的肾脏。这说明脾脏与肾脏相比，溶菌酶在体液免疫反应中的作用即使有也远远低于肾脏的作用。因而溶菌酶在水产动物防御机制中作为第三道防御屏障的肾脏和脾脏, 肾脏的作用远远地大于脾脏[11]。
鱼类除了有以上重要的免疫器官外，还有分散存在于黏液组织（如皮肤、鳃和消化道等）的淋巴细胞生发中心，被称之为黏膜相关淋巴组织（malt）。malt中具有杯状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞，鱼类杯状细胞分泌的黏液中具有一些酶的活性，如蛋白酶、碱性磷酸酶及溶菌酶等，还有一些广谱性的抗细菌、真菌成分，对抵御病原入侵有重要的作用[11]。本试验结果显示，4种鱼类肠粘膜虽然均具有溶菌酶的活性，但活性远远地低于同种鱼的肾脏和脾脏，而史氏鲟和小体鲟肠道里溶菌酶含量最高[12]。无鳞的黄鳝和黄颡鱼溶菌酶活性在肠粘膜，鳃中的溶菌酶均极显著地高于有鳞的鲫鱼和澳洲银鲈，但体表黏液里溶菌酶活性均极低，这与史氏鲟和小体鲟一致[12]，这些粘液组织里溶菌酶活性的差异说明作为水产动物第一道防御屏障的肠粘膜、鳃、体表黏液里的溶菌酶的防御功能大小因水产动物种类、食性、生活环境而异，尤其是无鳞鱼类（黄鳝、黄颡鱼、史氏鲟和小体鲟）体表粘液里极低的溶菌酶活性与实际生产过程中其体表作为第一道防御屏障的功能不相适应，这是否是由于粘液里的其它抗菌成分多或活性高，其防御功能足够强大，抑或是关于粘液里溶菌酶的收集、提取等试验方法的缺陷的原因还有待更进一步的研究。在比较所检测的4种鱼类相同组织溶菌酶活性后发现，无鳞的黄鳝和黄颡鱼溶菌酶活性在所检测的组织中均接近或显著地高于有鳞的鲫鱼和澳洲银鲈，而鲫鱼和澳洲银鲈、黄鳝和黄颡鱼间除肾脏外，其它组织间差异不显著，这表明无鳞鱼比有鳞鱼更依赖于溶菌酶的非特异性免疫，且溶菌酶在组织间的分布和作用更全面。
