原文作者：李西川

　摘 要：白念珠菌（candida albicans）是临床上引起系统真菌感染的主要病原真菌，在白念珠菌临床鉴定和基因组功能研究中，通常要提取其基因组dna以进行pcr。以白念珠菌菌落为材料，通过蜗牛酶处理后直接进行pcr，从而建立一种简捷快速的pcr模板获取方法。结果表明，该方法避免了提取转化子基因组dna的过程，可以大大提高工作效率。
 　　关键词：白念珠菌；菌落pcr；基因敲除；基因型验证
　　中图分类号：r379.4 文献标识码：a doi编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.07.003
　　establishment and application of colony pcr method in candida albicans
　　li xi-chuan
　　（basic medical research center， tianjin medical university， tianjin 300070， china）
 　　abstract： candida albicans was the most clinically important human fungal pathogen and causes system fungal infections. the preparation of candida albicans genomic dna was necessary in the clinical identification and genome functional research. here， a rapid colony pcr method by using the snailase treatment of candida albicans colony was described. the results showed that this method could largely increase working efficiency by avoiding the preparation of genomic dna.
 　　key words： candida albicans； colony pcr； gene disruption； genotype confirmation
 　　白念珠菌（candida albicans）是临床上最常见的机会型致病真菌，人体系统真菌感染主要是由白念珠菌引起的[1-2]。WWw.11665.com然而， 目前用于临床治疗系统真菌感染的药物数量有限， 而且菌株耐药性现象日趋加重。因此，对白念珠菌基因功能的研究近年来得到人们的普遍重视，这将为抗真菌药物新靶点的发现提供重要线索。人们对白念珠菌基因功能的了解通常通过传统的遗传学方法来实现， 即敲除目的基因然后观察基因缺失株的表型以发现该基因的功能。白念珠菌是双倍体， 通常需要分两步敲除两个等位基因（alleles）才能最终获得一个目的基因的纯合缺失突变体（homozygous mutant）。常用的敲除基因的方法有两种，一是1993年由fonzi创立的“ura-blaster”法， 目前仍被广泛使用[3-4]，二是直接pcr扩增含有标记基因的dna片断， 引入细胞内进行同源重组[5-7]。在使用这两种方法敲除基因的过程中，需要先后两次pcr检测敲除转化子的基因型，从而筛选到目标基因的杂合缺失突变体（heterozygous mutant）和纯合缺失突变体。由于白念珠菌转化效率的局限性， 经常需要通过pcr检测几十个甚至于上百个转化子的基因型才能得到一个正确的目标基因缺失突变体。因此，在转化子基因型验证试验中，按照传统的pcr方法，需要使用玻璃珠加酚/氯仿抽提法提取大量转化子的基因组dna做模板。这种方法工作量大，用时长，操作繁琐，严重限制了基因敲除效率的提高。此外，酚和氯仿对人体有毒害作用，试验后留下的残留物处理不当会污染环境。[论文网]
 　　在真核模式生物酿酒酵母菌（saccharomycease cerevisiae）的基因敲除工作中，人们已经建立了简捷、高效的菌落pcr方法用于菌株的基因型验证[8-10]。该方法从平板上挑取单菌落，通过简单处理后直接用于pcr，避免了提取基因组dna的过程。但是，到目前为止在白念珠菌基因敲除过程中尚无采用菌落pcr方法检测基因型的报道。本研究在参考酿酒酵母菌的菌落pcr方法的基础上，首次建立了白念珠菌的菌落pcr方法。该方法具有操作简捷、成本低廉且无环境污染的优点。
 　　1 材料和方法
　　1.1 材 料
　　1.1.1 菌株与引物 白念珠菌野生型菌株sc5314，rm1000和catco89基因的纯合缺失株（tco89δ/tco89δ）分别来自以前研究[4， 11]， rck2δ/rck2δ和ipf7530.2δ/ipf7530.2δ缺失株由本实验室构建。本试验中用到的所有引物由北京奥科生物技术公司合成。扩增ipf7530.2基因的900 bp片段的引物是ipf7530-if （5’ cgcgagctct gttgaccaga ggaggaa 3’） 和ipf7530-ir （5’ ggggtaccat ggttgctgca ttgac 3’）， 检测ipf7530.2/ipf7530.2：：hisg的基因型的引物是ipf7530-df（5’ ctggaggaga gcaaagacg 3’）和ipf7530-ir。扩增全长2.8 kb carck2基因的引物是carck2-f （5’ gcggatccaa tatacgctcc cctttgcg 3’）和carck2-r （5’ gcgaattcgg tttactctc tttgagtagg 3’）。扩增全长3.4 kb catco89基因的引物catco89-f和catco89-r来自以前的工作[4]。

　　1.1.2 主要仪器与试剂 pcr仪为eppendorf mastercycler gradient，离心机为eppendorf 5810r，酸洗玻璃珠为sigma分装，蜗牛酶购自天津华生生物科技有限公司，taq酶和500 bp dna ladder marker购自天津润泰科技发展有限公司。
 　　1.2 方 法
　　1.2.1 蜗牛酶处理 从固体ypd平板上挑取一个新鲜的白念珠菌单菌落，悬于200 μl 无菌水中，蜗旋混匀，5 000 rpm×1 min离心回收细胞。用200 μl buffer a（100 mmol·l-1 tris hcl，10 mmol·l-1 dtt，ph值9.4）重悬细胞，30 ℃摇床摇20 min，离心回收细胞。再用200 μl buffe

r b（1.2 mmol·l-1 sorbitol， 20 mmol·l-1 potassium phosphate buffer， ph值 6.8）重悬细胞，涡旋混匀后离心回收，重复1次。用100 μl蜗牛酶溶液（蜗牛酶溶于buffer b至终浓度10 mg·ml-1）重悬细胞，37 ℃水浴1 h。将酶解液放在100 ℃水中煮5 min，置于冰水浴中冷却后，直接用于pcr。
 　　1.2.2 pcr 反应的配样体系与反应程序 每100 μl pcr反应体系中加入2 μl上述煮过的细胞酶解液做模板，其他组分与普通pcr无差别。反应程序中循环数设为35。
 　　1.2.3 单菌落细胞处理 传统玻璃珠加苯酚/氯仿抽提法提取白念珠菌细胞基因组dna按以前方法[12]。为了寻找白念珠菌菌落pcr的最佳方案，用下面5种方法从单菌落细胞中制备pcr模板：⑴直接挑取少许单菌落细胞于pcr管中；⑵挑取一个单菌落重悬于300 μl水中，沸水煮5 min后的细胞液；⑶玻璃珠破碎的单菌落细胞悬液；⑷按以上1.2.1方法蜗牛酶处理过但不经沸水煮过的细胞；⑸经蜗牛酶处理和沸水煮过的细胞。其他dna操作和培养基配制按照《分子克隆》和《酵母遗传学方法实验指南》进行[9， 13]。
 　　2 结果与分析
　　2.1 不同处理方法对白念珠菌菌落pcr效果的影响
　　用传统玻璃珠加酚/氯仿抽提法提取白念珠菌细胞基因组dna做模板，我们可以pcr扩出清晰、单一的900 bp dna条带（图1泳道 1）。 与此相比，以未经处理过的单菌落细胞为模板（图1泳道2）和仅仅以玻璃珠破碎的细胞（图1泳道4）为模板均只能扩增出非常弱的目标条带，而以热水煮沸5 min的细胞为模板能够扩增出明显的目标条带（图1泳道3）。用蜗牛酶处理过但不用沸水煮的细胞液为模板能够扩增出清晰的目标条带（图1泳道5），而用蜗牛酶处理后再用沸水煮5 min的细胞液为模板的pcr扩增出的目标条带浓度最高（图1泳道6）。 这些结果表明，在这5种方法中，用蜗牛酶处理再经沸水煮5 min后得到的单菌落细胞液（水煮酶解液）作为模板，通过pcr能得到的目的产物最佳。
 　　2.2 水煮酶解液放置时间对pcr效果的影响
　　为检测水煮酶解液储藏条件对pcr效果的影响，把按1.2.1方案得到的rm1000细胞水煮酶解液在-20 ℃冰箱放置2个月。与新鲜处理过的rm1000细胞水煮酶解液相比较，放置了2个月的细胞水煮酶解液做模板经菌落pcr也能得到清晰高浓度的目标条带（图2泳道1和泳道2）。 这个结果表明水煮酶解液在-20 ℃冰箱放置2个月对pcr效果无影响。
 　　2.3 菌落pcr在白念珠菌基因敲除工作中的应用
　　我们实验室利用上述菌落pcr方案已经成功筛选到白念珠菌ipf7530.2，catco89和carck2等多个基因的缺失突变体。图3a是敲除ipf7530.2基因的策略，将构建好的ipf7530.2基因敲除盒转化到白念珠菌rm1000细胞中，在sd-ura平板上筛选ura+转化子。ura+转化子在5-foa平板上弹出ura3标记得到ura-转化子。使用菌落pcr的方法对这些ura-转化子进行基因型鉴定，结果从48个ura-转化子中成功筛选到3个ipf7530.2基因的杂合缺失突变体（ipf7530.2/ipf7530.2：：hisg）。 图3b中的第11号转化子（泳道11）就是其中一个。此外，还用同样的方法分别鉴定了白念珠菌catco89[4]和carck2[14]基因的杂合和纯合缺失突变体。
 　　2.4 白念珠菌菌落pcr方法在基因克隆中的应用
　　pcr模板的质量经常能够影响到扩增长dna片段的成功率，而据统计白念珠菌所有基因的平均长度为2～3 kb，所以白念珠菌基因克隆对模板质量要求更高。为了验证菌落水煮酶解液是否满足扩增长dna片段的要求，用rm1000的水煮酶解液为模板，对全长2.8 kb的carck2基因和3.4 kb的catco89基因进行了pcr扩增。结果表明，用水煮酶解液能够成功扩增这两个基因的全长，效果和传统的以玻璃珠/酚/氯仿法提取的基因组dna为模板得到的结果相似（图4a和图4b）。 这些结果证明，菌落pcr方法中的水煮酶解液也可以直接用于基因克隆。
 　　3 讨 论
　　白念珠菌是真核生物，有细胞壁，无法像大肠杆菌一样使用未经处理的菌落作为pcr模板。最常使用的白念珠菌模板为传统的玻璃珠法提取的基因组dna。笔者阐述了一种新型的白念珠菌菌落pcr方法：用蜗牛酶处理白念珠菌细胞，消化细胞壁，然后将酶解液放入100 ℃水中煮5 min使细胞破裂，用水煮酶解液作为模板进行pcr，获得了很好的pcr效果。试验证明，该方法可以成功应用于白念珠菌基因型鉴定和长达3.4 kb的基因的克隆。该方法具有如下优点：⑴简捷快速，整个过程只需要2小时；⑵成本低，本方法的成本约为传统玻璃珠加酚/氯仿法提取基因组dna成本的1/50；⑶健康无污染，本方法避免了有机试剂酚/氯仿的使用，改用酶学方法处理细胞，即有利于工作人员的健康也不会造成环境污染，是一种非常理想的试验方法，可以广泛应用于白念珠菌的研究工作中。

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