原文作者：刘冬梅

　　摘 要：为了分子生物学研究取材方便，确定了陆地棉‘洞a’花粉发育时期与花蕾外部形态对应关系：花蕾直径d=1～2 mm为减数分裂期；d=2～3 mm是4分体形成初期；d=3～4 mm为4分体期；d=4～5 mm处于双核期；d=5 mm为花粉粒形成初期；d=6 mm是成熟花粉期。
 　　关键词：陆地棉洞a；花粉；发育期；花蕾
　　中图分类号：s562 文献标识码：a doi编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.06.001
　　陆地棉‘洞a’是一系两用、增产10%～20%、且纤维品质优于常规棉花的品种，利用‘洞a’系已培育出4个陆地棉种内品种：川杂1号，川杂2号，川杂3号和川杂4号，并在此基础上衍生了一系列抗病、虫不育系。‘洞a’不育株与可育株除了在育性上存在差异外，在遗传背景上高度同源，是研究棉花花药与花粉发育相关基因的理想材料。如何选择最佳时间点，成为一个获得关键基因成功的关键。陆地棉‘洞a’是1972年在‘洞庭一号’中发现的一个天然不育突变株，经过连续回交选育而获得的[1]。遗传分析表明受一对隐性核基因控制，命名为msc1[2]。1992年，鉴定为新基因，定名为ms14[3]。20世纪80年代至今，对于‘洞a’的研究主要集中在细胞学观察及生化研究，对于分子生物学研究基础薄弱。目前仅限于胡磊[4]使用bsa法获得2个与ms14基因连锁的标记，分别是bnl3971和nau663，其中标记bnl3971距离ms14基因最近，相距16.7 cm。Www.11665.COm根据已公布的棉花图谱将ms14基因定位在了chr.2上。另外，应用cdna-aflp技术，分析‘洞a’雄性不育、可育材料花粉发育相关基因表达的差异，得到64条差异片段[5]。在植物发育的主要阶段至少有60 000个不同的结构基因表达，其中大多数为所有看家基因。kamalay等[6]和goldberg等[7]比较了花和营养器官的mrna后发现，大约有10 000种mrna为花药特异性的。尽管在花粉发育过程中，涉及近万种特异基因的表达，但是自从1987年第一次分离出植物的花药、花粉特异性基因以来，迄今所发现的花粉发育特异基因也不过几十种。这些花粉特异基因在植物发育过程中的表达，是受时间和空间调节的。除去某些持续表达的基因外，mascarenhas[8]将花粉形成过程中的基因表达分成早晚两个时期，早期基因的表达主要集中在减数分裂后即小孢子单核早期，而在成熟花粉中减少或完全消失；晚期基因的转录最早发生于小孢子有丝分裂时期，并且随着花粉的成熟继续积累。一般认为早期基因可能编码细胞骨架蛋白和参与细胞壁形成、淀粉积累的蛋白质。晚期基因表达的蛋白质则在花粉成熟和花粉萌发时起作用。‘洞a’不育株从小孢子母细胞到小孢子成熟的各个时期都产生不同程度的败育，最主要败育时期为小孢子单核时期[9]。侯磊等[5]研究发现：在花药发育的相同时期，不育和可育花粉的谱带在单核期的差异大于减数分裂期。花粉的内部发育与外部形态间有一定的稳定关系，而确定花粉的发育时期对于取材用于不育相关基因的研究将十分重要。到目前为止，未见系统出现从陆地棉‘洞a’的花蕾外部形态指标来判断不育株花粉的发育时期的文献。笔者旨在确定‘洞a’最重要败育时期即小孢子单核早期（四分体期）与外部形态的对应关系，并提供图片依据，进而可以准确、便捷地进行取材。同时对‘洞a’花粉发育影响因素进行讨论，为不育基因的研究提供方法和理论的参考。
 　　1 材料和方法
　　1.1 材 料
　　2011年在南宁市区试验田对陆地棉‘洞a’花粉的发育时期进行4次调查，4分体时期的花蕾直径：8月31日，d=3～4 mm； 9月13日，d=3～4 mm；9月28日，d=4～5 mm；10月26日，d=4～5 mm。
 　　1.2 方 法
　　1.2.1 取材 在花期分别标记不育株和可育株，分别摘取不同大小的不育株和可育株花蕾，速放置冰上，做到随摘随放。为了确定花蕾的外部形态和内部发育之间的关系，用千分尺量取花蕾最大直径处，为了达到准确一致，采取千分尺与铃柄平行的方式，直径每隔1 mm取1次样，直至成熟花粉。
 　　1.2.2 光学显微观察 用镊子在花蕾上形成丁字切口，剥开苞片，选取少量花蕾中间部分花药，置于载玻片上，先用镊子尽量夹碎，滴1滴蒸馏水，盖上盖玻片，用带橡皮的铅笔竖直敲打盖玻片，使花药壁破碎更加彻底，leica dm-lb型光学显微镜下观察拍照。[论文网]
 　　2 结果与分析
　　陆地棉‘洞a’不育是受一对隐性基因（ms·ms）控制的，当一对基因均为ms（纯合）时，植株表现为雄性不育；一对基因中其中一个为显性基因ms（杂合）时，植株表现为可育。亲本繁育时，用可育株（ms·ms）的花粉授于不育株（ms·ms）的花， 所产的种子来年种植后，可育株与不育株仍各为50% ，因一系两用（不育系、保持系），故称两用系。从图1可以看出，不育株花药不开裂，花药细小，柱头较长；可育株花粉散开，较粗壮。
 　　3 结论与讨论
　　从以上细胞学研究的结果，归纳出‘洞a’花粉发育时期与外部形态对应关系：花蕾直径d=1～2 mm为减数分裂期；d=2～3 mm是4分体形成初期；d=3～4 mm处于4分体期；d=4～5 mm是双核期；d=5 mm为花粉粒形成初期；d=6 mm是成熟花粉期。小孢子从4分体初期（小孢子单核早期）开始，出现明显的败育现象，如4分体间的横隔消失、内容物减少、外泄，有的内容物全部消失等现象，致使发育停滞。即使可以进入下一阶段，也不能发育成具有育性的花粉粒。说明小孢子单核早期是败育的最主要和关键时期，此时期也是研究育性转换关键基因的最佳时期。
 　　郝天峰等[12]研究了‘洞a’不育系的衍生系抗a1不育株为低温不育、高温可育，与光照关系不大。花粉量的多少与其开花前7～11 d和9～13 d的日平均温度呈极显著正相关关系，因此，初步认为其育性转换的敏感期为开花前7～13 d。棉花核不育系抗a1育性转换不育株后代，在处理温度为25～26 ℃条件下，表现完全不育；27～28 ℃出现不育和半不育并存的现象；在29 ℃表现完全可育。从其结果可以看出，抗a1育性转换的开关的不育株上，高温就可以转变成可育株。但从‘洞a’在田间的表现来看，高温时可育株的数量并没有增加，只是低温会使可育株育性降低。调取南宁市区4次调查前10 d的日平均气温，分别是：24.7，24.5，20.3，19.8 ℃。从结果可以看出，温度在24.5 ℃以上的时候，对花粉发育没有影响，可以按照笔者研究的结果进行取材。关于植物雄性不育花粉败育过程前人早有评述，认为花粉败育的形式和时期是多种多样的，随植物不同而异，败育时期受遗传和环境相互作用所制约。对于陆地棉不育系‘洞a’育性转化的条件还有待于进

一步研究。

　　参考文献：
　　[1] 唐雯，张相.棉花“洞a”型核雄性不育形态及机理研究现状[j].安徽农业科学，2008，36（4）：1402-1404.
　　[2] 黄观武，张东铭，苟云高，等.对我国陆地棉雄性不育基因的初步分析[j].四川农业科技，1982（2）：1-4.
　　[3] 张天真，冯义军，潘家驹.我国发现的4个棉花核雄性不育系的遗传分析[j].棉花学报，1992（4）：1-8.
　　[4] 胡磊.棉花核雄性不育基因ms_（14）及农艺性状ssr分子标记定位的研究[d].乌鲁木齐：新疆农业大学，2009.
　　[5] 侯磊，肖月华，李先碧，等.棉花洞a雄性不育系花药发育的mrna差别显示[j].遗传学报，2002，29 （4）：359-363.
　　[6] kamalay j c， goldberg r b.organ-specific nuclear rnas in tobacco[j]. proc natl acad sci， 1984，81（9）：2801-2805.
 　　[7] goldberg r b，beals t p，sanders p m.anther development：basic principles and practical applications[j].plant cell，1993，5（10）：1217-1229.
 　　[8] mascarenhas j p.gene activity during pollen development[j]. annual review of plant physiology and plant molecular biology，1990（41）：317-338.
 　　[9] 汤泽生，杜素琼，王祖秀，等.棉花“洞a”小孢子发育的细胞形态学研究补遗[j].南充师院学报：自然科学版，1982（2）：28-31.
　　[10] 汤泽生.棉花雄性不育论文集[m].成都：四川省科学技术出版社，1989.
　　[11] 汤泽生，王祖秀，徐林，等.棉花海洞不育系小孢子败育的研究 [j].南充师院学报：自然科学版，1985（2）：1-3.
　　[12] 郝天峰，何觉民，郭宗学，等.花核不育系抗a1育性转换不育株育性变化与温度的关系[j].广东农业科学，2007（3）：13-15.