【摘要】 目的 研究蛴螬粗提物对人宫颈癌hela细胞诱导凋亡作用，并探讨其作用机制。方法 采用流式细胞仪检测hela细胞的细胞周期分布相和细胞凋亡率；末端脱氧核苷酸转移酶（tdt）介导的脱氧核苷酸缺口末端标记（tdtmediated dutp nick end labeling）tunel法检测凋亡细胞；通过免疫细胞化学sp法测定凋亡相关基因产物p53、fas、bcl2、bax蛋白的表达情况。结果 (1)蛴螬粗提物可以诱导hela细胞发生凋亡，加药组出现亚二倍体峰，并且g0/g1期细胞比例显著增加（p＜0.01），而s期和g2/m期细胞比例则明显下降,将细胞阻滞在g0/g1期；（2）蛴螬粗提物作用细胞后凋亡细胞数目随时间延长而增多，凋亡指数与药物处理呈时间依赖性和剂量依赖性；(3)蛴螬粗提物作用后bcl2、p53蛋白随提取物浓度表达均下降，bax、fas蛋白表达上升，四种蛋白表达各组间比较差异均有具有统计学意义（p<0.01）。结论 (1) 蛴螬粗提物对人宫颈癌hela细胞具有诱导凋亡作用；(2)蛴螬粗提取物诱导凋亡作用机制可能与细胞周期发生g0/g1期阻滞有关；并且通过下调bcl2、p53蛋白表达,上调bax、fas蛋白表达，经由细胞凋亡的死亡受体通路和线粒体通路完成凋亡的启动和执行。
【关键词】 蛴螬粗提物；hela细胞；凋亡； bcl2；bax；p53； fas
inducing apoptosis effects and mechanism on hela human cervical carcinoma cells by grub extract
li xiangdan1,sun shu1,2,,song lianlian1,yang wanshan1
1.department of pathology,medical college of yanbian university yanji 133000,china;2.key laboratory of natural resources of the changbai mountain and functional molecules,ministry of education,yanbian university
corresponding author:sun shu,email:[email protected]：objective to investigate the effect of the grub extract on proliferation and apoptosis of hela human cervical carcinoma cells in vitro and explore its probable molecular mechanisms.methods the distribution of cells cycle and the apoptotic rate were observed by flow cytometry.apoptotic cells were determined by the terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dutp nick end labeling (tunel) method.the p53,fas, bcl2,and bax proteins were determined by immunohistochemical sp staining technique.results (1) the grub petroleum extract was able to induce the apoptosis of hela cells;typical subdipioid peaks were observed.the percentage of cells in g0/g1 phase were increased while the percentage of cells in s and g2/m phase were decreased after the grub extract treatment so the grub extract could arrest hela cells in g0/g1 phase; (2) the apoptosis of hela cells induced by the grub extract was in a concentration and time dependent manner.(3) after treated with the extract,bcl2 and p53 protein expressions were decreased while bax and fas were increased; the expression of four kinds protein were significantly changed between different treatment groups (p<0.01).conclusion (1)the grub petroleum ether extract has significant inhibition of proliferation and inducing apoptosis for hela human cervical carcinoma cell line in vitro.(2) apoptosis of hela cells induced by the grub petroleum ether may be related with arresting cell cycle in g0/g1 phase.the mechanism of inducing apoptosis for hela might be related by downregulation expression of bcl2、p53 and upregulation expression of bax、fas.it might be induce apoptosis in hela cells by the fasdependent pathway and mitochondria pathway.
key words：grub extract; hela cell; apoptosis;bcl2; bax; p53; fas
0引言
蛴螬，为鳃金龟科昆虫大黑鳃角金龟[holotrichia diomphalia(bates)]的干燥幼虫。www.11665.COm在祖国传统中医药学中作为药材有破血、行淤、散结、通乳等功效，用于折损淤痛、破伤风、喉痹、目翳等病症。近年来有报道蛴螬等多味中药复方药物对人胃癌mgc803细胞株具有诱导凋亡作用［1］。还有研究表明蛴螬提取物对人胃癌mgc803细胞株具有体外抑瘤活性［2］。目前，国内外尚未见应用蛴螬粗提物对hela细胞株的研究，本实验旨在进一步阐明蛴螬的抗癌作用及其机制，为天然药物蛴螬的开发提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株和主要试剂
人宫颈癌hela细胞株购于中科院上海细胞所。rpmi medium 1640培养基为gibco公司产品。新生小牛血清为中美合资兰州民海生物工程有限公司产品。胰蛋白酶（tripsin）为difco公司产品。bcl2、bax、p53单克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司。fas蛋白单克隆抗体购于福州迈新生物技术开发有限公司。原位细胞凋亡检测试剂盒为罗氏公司产品。cycle testtm plus 试剂盒为美国becton dikinson公司产品。no.340242蛴螬石油醚粗提物由延边大学药学院植物化学教研室分离提供。facs—calibur型流式细胞仪为美国becton dikinson公司产品。
1.2 体外细胞培养
人宫颈癌hela细胞贴壁生长于rpmi1640培养液（含10％新生小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml）置于37℃，5％co2浓度及饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。
1.3 蛴螬粗提物制备和配制
蛴螬购于延边利民药店，经延边大学药学院医药研究中心刘永镇教授鉴定为正品。称取蛴螬5kg粉碎备用，用工业甲醇回流提取三次，在水浴上挥尽溶剂，加水制成混悬液后，依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿等萃取，得到石油醚萃取物60.62g用于本次试验。初步化学成分分析实验显示，蛴螬石油醚萃取的粗提物中含有甾体化合物及脂肪酸等成分，其中甾体化合物约占3.5%。石油醚粗提物用少量0.5%羧甲基纤维素钠生理盐水和tween80溶解，tween80在药液中的最高体积分数低于1×10－4[3]。
1.4 流式细胞仪检测
取对数生长期的hela细胞,胰酶消化制成浓度为1×105个/ml的细胞悬液,置于100ml的培养瓶中培养,再加入蛴螬石油醚提取物使其终浓度为50μg/ml，同时设立对照组。共培养24h、48h和72h后收集细胞，用pbs缓冲液洗涤细胞2次，加入适量的pbs制成细胞悬液，用cycle testtm plus dna kit染色，在流式细胞仪上测试记录激发波长为488nm的红色荧光，检测hela细胞的凋亡率和细胞周期分布。检测前以鸡红细胞作为标准样品调整cv值在5％以内，每份标本检测20000个细胞，加药组与对照组均重复3次。采用mod fit 3.0软件分析细胞周期。
1.5 tunel法细胞凋亡检测
hela细胞经25μg/ml和50μg/ml蛴螬粗提物终浓度处理24、48h后，吹打制成细胞悬液；离心、洗涤细胞2次；4％多聚甲醛0.1ml固定30min，取细胞悬液均匀涂布于载玻片上，制成细胞涂片，设立对照组。待做tunel检测。应用tunel法原位检测试剂盒检测hela的凋亡，用0.1％核固红溶液复染。每次tunel染色中以已知阳性物质的乳腺癌组织切片为阳性对照，以不含tdt的tdt buffer代替tunel反应混合液作阴性对照。结果判断：细胞凋亡阳性物质呈紫蓝色位于细胞核内，部分细胞浆也可因核dna碎片的逸出呈阳性着色；阴性细胞呈淡红色。每张涂片在400×高倍镜下观察5个视野，每个视野下分别计数凋亡细胞和总细胞数并计算凋亡指数（apoptosis index,ai），即凋亡率。
ai（％）=凋亡细胞数/总细胞数×100％。
1.6 免疫细胞化学染色
取对数生长期的hela细胞制成1×105个/ml的细胞悬液，接种于内铺小玻片的12孔培养板内。待贴壁生长后，分别加入25μg/ml和50μg/ml蛴螬粗提物终浓度药液处理24h后取出待做免疫细胞化学染色。染色操作按sp试剂盒说明书进行。染色结果判断：以细胞内见清晰棕色颗粒为阳性细胞。bcl2、fas和bax在胞质中呈棕黄色阳性表达；而p53以细胞核为阳性定位，以细胞未着色或轻微着色为阴性。每一指标观察3张涂片或细胞爬片，每张片在400×高倍镜下观察5个视野，每个视野下分别计数阳性细胞数和总细胞数并计算阳性表达率。阳性表达率（％）=阳性细胞总数/总细胞数×100％。pi代表每一着色程度的细胞所占的比例为0～100％，hscore＝∑pi（i+1）,满分为4分。免疫细胞化学染色设立阳性对照和阴性对照。
1.7 统计学方法
应用spss10.0软件：数据用±s表示；凋亡率之间的比较采用方差分析多样本均数间q检验；bcl2、bax、 p53、fas蛋白表达组间率的比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期改变
流式细胞术检测结果显示蛴螬提取物50μg/ml作用于hela细胞株24、48、72h均出现诱导g0/g1期阻滞,阻滞细胞由g1期向s期的转化，随处理时间延长g0/g1期细胞含量上升，s期细胞下降。蛴螬加药处理组均有亚g1峰出现，并在72h前呈时间依赖性（p＜0.01）。72h蛴螬提取物作用组凋亡率降低，但是g0/g1期阻滞明显，见图1。
2.2 tunel染色法检测蛴螬粗提物对hela细胞诱导凋亡作用
tunel染色法镜下可见癌细胞发生两种变化，一种为细胞凋亡，表现为细胞体积缩小，核固缩，胞浆减少，可见核内出现大小不等的蓝色颗粒，有的弥散分布，有的偏侧分布或核膜周边分布。另一种变化为细胞肿胀，胞膜破裂，内容物流出而坏死。
随着剂量和时间的延长凋亡细胞数量增加。结果表明hela细胞的凋亡率与蛴螬粗提物浓度之间存在剂量和时间依赖关系，见表1。表1 蛴螬粗提物对人宫颈癌hela细胞凋亡率的影
2.3 免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白表达水平
光镜下观察可见：p53蛋白染色位于细胞核；bcl2蛋白染色位于细胞浆内，对照组阳性颗粒在胞浆内均匀分布，阳性细胞数居多，实验组阳性细胞数减少，染色明显变浅；bax蛋白染色阳性部位主要见于胞浆，呈细颗粒状均匀分布。实验组随提取物浓度增加，出现越来越多胞体浓缩变圆的细胞，这些细胞可见bax阳性信号广泛分布于胞核和胞浆。而这种转位表达于核内的异位表达现象，只见于那些出现显著染色体和胞浆浓缩的细胞（凋亡细胞）[4]。其中bcl2与bax细胞爬片中可以见到细胞浆中出现较大的脂肪溶解后残留的空泡，细胞膜尚完整。在相同作用时间随着提取物浓度的增加p53、bcl2蛋白表达下降，bax和fas蛋白表达增强，与对照组相比差异具有统计学意义（p<0.01），见表2。表2 蛴螬提取物对p53、bcl2、bax和fas蛋白表达的影响作用
3 讨论
肿瘤的发生发展是一种多基因、多步骤、多阶段的复杂过程。随着分子生物学和分子病理学研究的进展，人们意识到细胞凋亡在肿瘤的发生和发展中扮演重要角色，通过细胞凋亡途径诱导肿瘤细胞死亡，已成为肿瘤研究的热点之一。大量的实验研究表明，中药通过多种因素作用于分子靶点干扰肿瘤细胞的生长、代谢、增殖等过程，最终使肿瘤细胞发生凋亡。
目前，用于检测凋亡细胞dna断裂的方法中，最常用、最简便的就是dna含量分析。本实验结果中可以发现在dna直方图上正常二倍体细胞的峰g0/g1前出现一个亚二倍体峰（subg1峰，即ap峰apoptotic peak）,根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞的百分率，同时结合被检测细胞的dna含量分析，可确定被检测细胞所处的细胞周期。
细胞阻滞于哪一期，细胞凋亡就发生在哪一期［5］。蛴螬提取物50μg/ml作用于hela细胞株24、48和72h均出现诱导g0 /g1期阻滞,阻滞细胞由g1期向s期的转化，随作用时间延长g0/g1期细胞含量上升，s期细胞下降；证实蛴螬提取物可以引起hela细胞株g0/g1期阻滞和诱导凋亡，将细胞阻滞于g0/g1期，抑制dna合成。本实验又应用tunel观察了蛴螬提取物诱导细胞凋亡的情况，实验结果表明，随着剂量和作用时间的延长，凋亡率增加，使细胞向凋亡方向发展，由此推断这可能是蛴螬提取物完成其抗肿瘤作用的机制之一。
p53基因是目前公认的抑癌基因，有野生型和突变型。野生型p53作为细胞生物的“监控器”阻止细胞由g1期进入s期。另一方面还能够诱导细胞凋亡。当p53基因发生缺失或异常时，不仅丧失了抑癌活性，反而具有促进恶性转化的功能，因此由抑癌基因转化为癌基因。本实验结果显示p53蛋白表达随药物浓度的增加明显下降，与对照组相比差异具有统计学意义。由于野生型p53蛋白半衰期短、代谢不稳定、常规免疫组化方法一般难以测出。所以本实验检测到的应是突变型p53。本实验结果说明蛴螬提取物可能通过调控p53蛋白表达下降而促进细胞凋亡。
fas是肿瘤坏死因子受体（tnfr）和神经生长因子（ngf）受体家族的细胞表面分子，fas配体（fasl）是tnf家族的细胞表面分子。fas／fasl主要作用是可以触发细胞凋亡。本实验结果显示fas蛋白表达随药物浓度的增加而明显增强，说明蛴螬提取物可能上调hela细胞表面的fas蛋白表达，通过凋亡通路中的死亡受体通路促进细胞凋亡。
bcl2基因已证实为癌基因，bax作用则相反。bcl2和bax形成了细胞凋亡的正负调控，诱导细胞凋亡[6]。本实验结果显示，随提取物浓度增加，bcl2/bax比例下调，说明蛴螬粗提物诱导hela细胞的凋亡过程可能是下调bcl2蛋白和上调bax蛋白的表达，通过凋亡通路中线粒体的途径实现的。
【参考文献】
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[3] yuan j p,ling h,zhang mx,et al.effect of diallyl disulfide on apoptosis and cell cycle arrest of human gastric cancer mgc803 cells［j］,chinese pharmacological bulletin,2004，20（3）:299302.
[4] 李江，于欣欣，杨新科.bax基因过表达诱导肿瘤细胞凋亡[j].中华消化杂志，2001，21（2）；114116.
[5] 姜浩， 樊光华.人参皂甙rh2对人肝癌bel7404细胞增殖和凋亡的影响[j].中国肿瘤临床与康复，2004，11（4）：289292.
