【摘要】 目的 探讨一帕金森病(pd)家系的临床特征及进行park1基因g88c(位于3号外显子)、g209a(位于4号外显子)突变分析。方法 该家系祖籍为吉林省白山市，汉族，可追溯4代25人，其中9例发病(3人已去世)，4人可疑。家系图谱分析为一常染色体显性遗传大家系，总结该家系发病的临床特征。采家系成员外周抗凝血提取基因组dna，利用聚合酶链限制性长度多态性分析(pcrrflp)技术检测park1基因第3、4号外显子是否存在突变。所得产物利用琼脂糖凝胶电泳及凝胶成像分析系统进行分析。结果 该家系有典型pd临床表现，且具有发病年龄早、发病成员临床症状相似等特点。采集的所有血标本的扩增产物分别经mvai和nmuci酶切后未见小分子片段，未发现g88c、g209a错义突变。结论 该家系为以震颤及强直为主要临床特征的常染色体显性遗传pd大家系，该家系不存在park1基因错义突变。有待于进一步查找该家系的致病基因。
【关键词】 帕金森病;家系;基因;限制性片段长度
近年来的研究表明帕金森病(pd)的发病具有遗传学基础，随着家族性pd致病基因的相继定位与克隆，分子遗传学在pd发病机制中的作用越来越受到关注。家族性pd虽少见，却为研究pd的遗传因素提供了极好的机会和条件，为探索pd的发病原因及新的治疗方法提供思路。park1(αsynuclein)是首先被发现的与遗传性pd有关的基因，已有两个点突变g88c和g209a被确认。Www.11665.cOM目前关于park1基因突变在我国大的pd家系中的研究报道较少，尤其是在北方的家系研究中未见，本文对搜集到的一个北方pd常染色体显性遗传大家系进行研究，筛查是否存在park1的g88c及g209a错义突变。
1 资料与方法
1.1 家系资料 该家系祖籍为吉林省白山市，汉族，可追溯4代25人，其中9例发病(3人已去世)，4人可疑，呈常染色体显性遗传模式。见图1。pd临床诊断依据2006年中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组制定的pd诊断标准。该家系发病成员起病年龄为20～40岁，具有典型pd症状，均以震颤及强直起病，伴有不同程度的pd非运动症状，无明显智能减退，口服左旋多巴治疗有效，症状逐年加重。先证者女性，1951年出生，于1997年于吉林大学第二医院神经内科确诊为pd。查体(服息宁控释片50/200半片后1 h)：血压110/70 mmhg，面部表情僵硬，双腕部张力呈齿轮样增高，双上肢肌张力轻度铅管样增高，双下肢肌力铅管样增高，以右侧肢体为重。走路协同动作减少，前驱前倾体姿。病理反射阴性。常规生化检查未见异常，头部mri未见异常。共搜集6名已发病患者的临床及血液样本资料，并搜集家系成员12例血液样本。
图1 帕金森病一家系图谱
1.2 方法
1.2.1 dna提取 所有家系成员均取肘静脉血8 ml枸橼酸钠抗凝，采用takara全血基因组dna提取试剂盒提取白细胞基因组dna。
1.2.2 聚合酶链反应(pcr) park1 3、4号外显子pcr引物序列均参照polymeropoulous文章〔1，2〕。见表1。引物均由上海sagon公司合成，反应体系含：50 ng/μl gdna 2.0 μl，100 μmol/l dntp 2.0 μl，50 ng/μl引物各1.0 μl，10×pcr缓冲液(含mgcl2)5 μl，taq酶0.2 μl，加ddh2o至50 μl，10×pcr缓冲液和taq酶均由takara公司生产。pcr反应条件：94℃ 5 min;94℃ 30 s，外显子3 49℃(外显子4 55℃) 30 s，72℃ 40 s，共30个循环;72℃ 延伸6 min。以1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(eb)染色，在紫外灯下观察结果，并用takara pcr产物纯化试剂盒对产物进行纯化，利于酶切反应。表1 扩增park1 3、4号外显子片段所用引物序列
1.2.3 限制性片段长度多态性分析(pcrrflp) pcr纯化产物各取20 μl，分别用限制性内切酶mvai(外显子3)及nmuci(外显子4)在37℃恒温下酶切4 h(两种限制性内切酶产地为mbi)，产物以1%琼脂糖凝胶电泳，eb染色，凝胶成像系统下观察结果并摄像。若存在g88c突变，外显子3产物可被mvai酶切为136和56 bp两个片段;若存在g209a突变，外显子4产物可被nmuci酶切为128和88 bp两个片段。
2 结 果
18名家系成员(包括已发病的成员)的dna模版，经pcr
扩增后均获得了192 bp及216 bp的产物，所有产物分别经过mvai(外显子3)及nmuci(外显子4)酶切后均未获得切开片段。见图2。
3 讨 论
迄今为止，pd的药物治疗还只是对症治疗，并不能延缓疾病的进展，研究家族性pd患者基因突变很有可能为从分子水平阐明pd发病的潜在机制起作用，同时也能从预防和延缓疾病进展方面，为探索pd新的治疗方法提供思路。对pd家系的致病相关基因进行研究将有助于pd的临床诊断、遗传咨询，并可能对该病的治疗和预防有重要意义，并有可能发现新的基因突变类型或新的致病基因，故研究家族性pd的致病基因有重要的意义。pd的遗传学病因一直是神经病学研究的热点话题。近年来，关于基因方面的研究进展很快，已经发现13个染色体位点以孟德尔遗传方式与pd连锁，其中呈常染色体显性遗传的有8个，常染色体隐性遗传的4个，有一个尚未完全明确遗传方式〔3〕。常染色体显性遗传性pd的临床特点概括来说包括起病年龄早(平均年龄在50岁以下)，痴呆发生率高，病程短，对多巴胺治疗反应良好。病理学改变为lewy体pd。
1996年polymeropoulos等〔1〕对一个意大利呈常染色体显性遗传(ad)的pd家系进行基因组扫描和连锁分析后，将致病基因定位于4q2123，并于1997年克隆了该致病基因αsynuclein基因，确定其致病原因为park1基因在第4号外显子上的1个错义点突变g209a所致，使其编码的53位氨基酸由丙氨酸(ala)置换为苏氨酸(thr)。1998年在一德国常染色体显性遗传pd家系中发现了该基因的另一个点突变位点，位于3号外显子的g88c突变，导致第30位的丙氨酸(ala)被脯氨酸(pro)置换〔4〕。自该基因被定位，之后许多科学家在家族性pd中筛查这两个突变位点，只是在部分希腊家系中获得阳性结果，其他地域的研究绝大多数为阴性结果。目前家系研究显示，该基因可能仅构成少量以发病年龄早、外显率高、常染色体显性遗传为特征的家族性pd的致病基因。该基因的突变是罕见的，在pd患者中占不到1%〔5〕。本研究中该常染色体显性遗传大家系中也未见此突变。
下一步将在该家系中继续进行其他常见基因突变位点的筛选，并继续进行本地pd家系的收集，为进行遗传连锁分析打下基础。通过研究目前已发现的家族性pd家系的致病基因，也为今后更多的家族性pd的研究提供新思路。
【参考文献】
1 polymeropoulos mh,higgins jj,golbe li,et al.mapping of a gene for parkinson′s disease to chromosome 4q21q23〔j〕.science,1996;274(5290)：11978.
2 polymeropoulos mh,christian l,elisabeth l,et al.mutation in the αsynuclein gene identified in families with parkinson′s disease〔j〕.science,1997;276(5321):20457.
3 serena r,nir g,avi ou.advances in the genetics of parkinson′s disease〔j〕.acta pharmacol sin，2008;29(1):2134.
