【摘要】  目的 筛选金耳菌丝体抗凝血的有效部位。方法 采用系统溶剂法处理金耳菌丝发酵物,得乙酸乙酯部位、正丁醇部位及水溶部位,通过凝血酶原实验、小鼠凝血实验及小鼠体内血栓形成实验等来筛选具有抗凝血作用的有效部位。结果 金耳菌丝体的正丁醇部位表现出较好的抗凝血作用,乙酸乙酯部位及水溶部位表现出微弱的活性。结论 金耳菌丝体抗凝血的有效部位为正丁醇提取部位。

【关键词】  金耳；菌丝体；抗凝血
　　
　　abstract：objective to study the effective anticoagulant components of the fermented products of mycelium from tremella aurantialba 9800. method to adopt system menstruum deal with fermented products of mycelium from tremella aurantialba, then mycelium from tremella aurantialba was studied with the clotting time of the thrombogen, the whole blood clotting time in mice and thrombosis experiment in mice. result butanol extract of fermented products of mycelium from tremella aurantialba behave anticoagulant function. ethyl acetate extract and water extract also behave feeble activity. conclusion the effective anticoagulant components of the fermented products of mycelium from tremella aurantialb is butanol extract.
   
　　key words：tremella aurantia；mycelium；anticoagulant
 
    金耳(tremella aurantia)又名黄金银耳、黄木耳、金木耳、黄耳、脑耳、胶耳等,是一种稀有野生名贵食、药用菌。WWw.11665.COm分类地位属担子菌纲,银耳目,银耳科,银耳属,是银耳的近缘种,其生物学特性有许多相似之处,具有较高经济价值。据《中国药用真菌》记载,金耳性温中带寒,味甘,能化痰、止咳、定喘、调气、平肝肠,主治肺热、痰多、感冒咳嗽、气喘、高血压等。经对其进行深层发酵研究,发现菌丝发酵产物与原子实体相比无论成分与药用价值,前者均具有很大的应用价值[1]。刘氏等[2]以小白鼠血栓形成和大鼠脑脂质过氧化物等为指标,研究了金耳菌丝全发酵产物的抗凝血及抗血栓形成作用,对金耳菌丝发酵产物防治缺血性脑中风,治疗脑梗死、脑缺氧导致的肌力丧失、手足麻木、意识不清等症进行了初步的探索,但还需继续深入研究该产物的有效部位,进一步确定其物质基础及其药理作用机制。因此,我们采用系统溶剂法将金耳菌丝发酵产物分为若干提取部位,以几个提取部位为研究对象,通过抗凝及抗血栓形成等实验,深入探讨其抗凝血的有效部位。

　　1  实验材料

　　1.1  动物

    昆明种小鼠,体重(22±0.89)g,雌雄各半；wistar大鼠,体重(261±1.56)g,雌雄各半,均由中国医学科学院实验动物中心提供,合格证号(95)01-3008。

　　1.2  药物

    金耳9800菌丝发酵物(简写为tm),采用山西省生物研究所自主分离驯化的金耳9800菌种发酵制得,批号20050511。

　　1.3  试剂与仪器

　　dade ci-trol 1(德灵试剂),dade behring公司,批号060512；乌拉坦,上海化学试剂采购供应站经销,批号990309；羧甲基纤维素钠(cmc-na),河北省蓝博化工厂生产,批号050816；其它化学试剂均为国产分析纯。ca-50自动血凝分析仪；旋转蒸发仪re-52a(上海亚荣生化仪器厂)。

　　2  实验方法[2-6]

　　2.1  金耳菌丝体发酵物各部位的提取与分离
   
　　称取干燥菌丝体,分别用12倍量、10倍量70%的乙醇提取2次,每次2 h,过滤,滤液减压回收乙醇,以水混悬,用石油醚脱脂,后分别用乙酸乙脂、正丁醇萃取5次,减压回收乙酸乙酯、正丁醇,冻干,分别得乙酸乙酯提取部位、正丁醇提取部位、水溶性部位,冷藏备用。用时以1%的cmc-na溶液混悬成不同浓度供药理筛选。

　　2.2  各提取部位对凝血酶原作用的影响

    乌拉坦(1.5 g/kg)麻醉大鼠,固定,分离腹主动脉取血(3.8%枸橼酸钠抗凝)。离心分离血浆。受试药物分别制成终浓度为100 mg/ml(高剂量组)、50 g/ml(低剂量组)的溶液。每管血浆0.045 ml,加入不同浓度的受试药物0.05 ml ,致凝剂(德灵试剂)0.10 ml,总体积为0.15 ml。于血凝分析仪上测定其凝血酶原时间,等量生理盐水作空白对照。记录凝血酶原时间。

　　2.3  各提取部位对小鼠体内血栓形成的影响
   
　　取小鼠70只,随机分为7组,10只/组,ig给药3 d,高剂量组1.0 g/(kg·d),低剂量组0.5 g/(kg·d),于最后一次给药1 h后,尾静脉注射配制好的鼠脑粉试剂0.1 ml/10 g,待小鼠出现呼吸困难、惊厥、小便失禁、直至死亡,存活者按5 min计,记录小鼠存活时间及死亡率。

　　2.4  各提取部位对小鼠全血凝血时间的影响(毛细玻管法)
   
　　取健康小鼠70只,随机分成7组,每组10只,ig给药3 d,第3天给药1 h后,用内径为1 mm的玻璃毛细管插入小鼠眼球后静脉丛取血,至毛细管内血柱达5 cm,将毛细玻管平放于桌上,每隔30 s,折断毛细玻管约0.5 cm,缓慢左右拉开,检查有无出现血凝丝。记录从血液流进管内至出现血丝的时间,即为凝血时间。

　　2.5  统计学方法

    数据以x±s表示,统计学检验采用组间t检验进行处理。

　　3  结果

　　(见表1～表3)  表1  金耳菌丝发酵物各提取部位对小鼠凝血酶原的影响(略)注：与生理盐水组比较,*p<0.05,**p<0.01(下同)。表2  金耳菌丝发酵物各提取部位对小鼠体内血栓形成的影响(略)表3  金耳菌丝发酵物各提取部位对小鼠全血凝血时间的影响(略)

　　4  讨论
   
　　金耳菌丝发酵产物各提取部位药理研究结果表明,正丁醇部位高、低剂量组对凝血酶原时间及小鼠体内血栓形成皆有较显著影响,并呈现一定的剂量-效应关系,对小鼠凝血时间也有一定的影响；乙酸乙酯部位高剂量组对小鼠体内血栓形成有一定的影响,但对凝血酶原时间及小鼠凝血时间,影响不大；而水溶部位高剂量组能够一定程度延长凝血酶原时间,但对小鼠凝血时间及小鼠体内血栓形成无影响。这种现象可能是由于有效成分交叉存在于相邻组分中而导致的。综上可知,正丁醇部位是金耳菌丝发酵物抗凝血的有效部位,但其有效成分的化学本质及其发挥抗凝血作用的药理机制还需进一步探讨。
   
　　血栓形成与血栓栓塞是导致心血管疾病的因素之一,抗凝血和溶栓是有效的治疗方法。因此,寻找此类药物是重要的药学课题。金耳经过发酵可大量获得,而且作为开发此类药物的原料成本经济,前景可观。

【参考文献】
  　　[1] 谢 红,刘春卉,苏槟楠,等.金耳8254 的营养价值和药理研究[j].中国食用菌,2000,(6)：39－41.

　　[2] 刘春卉.金耳菌丝发酵产物抗血栓的生物活性研究[j].天然产物研究与开发,2003,(4)：289－292.

　　[3] 吴祯久.洋虫对小鼠凝血时间和出血时间的影响[j].中药材,1996, 19(7)：361.

　　[4] 陈 奇.中药药理研究方法学[m].北京：人民卫生出版社,1993.481－484.

　　[5] 徐叔云,卞如濂,陈 修.药理实验方法学[m].北京：人民卫生出版社, 1994.1119－1123.

　　[6] 秦元满.狭叶寻麻抗凝血有效部位的探讨[j].中国中医药科技,2006, 13(2)：72.