作者：华强,杨蟠储,王国华,郭书文

【关键词】  心脏；基因表达；基因芯片技术

          目前,基因芯片技术已广泛应用于医学各学科中,如在基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析以及疾病的诊断、治疗和预防、药物筛选、基因测序等均发挥着重要的作用[1]。自1999年基因芯片技术进入心血管系统研究以来[2-3],已在心脏发育、心肌损伤重塑以及心血管病中西医研究中取得了一定成绩,但存在的问题随之出现,值得深思并深入研究。

　　1  心脏发育过程中的基因表达情况尚未取得一致
    　　了解正常动物发育过程中心脏的基因表达情况及意义,对心脏疾病的诊断、治疗等有重要的价值。sehl等[4]比较了13 d胎鼠和出生后1 d乳鼠的基因表达,表明在发育过程中,心肌心房钠尿肽、b-型钠尿肽、osteopontin、ⅲ型胶原、fibronetin等基因表达发生了改变,而在心肌缺血损伤重塑过程中,这些基因也有类似的表达改变。有应用超声心动术检测8、10、12周龄wistar大鼠的心脏结构和功能指标,同时应用cdna基因芯片技术观察心脏基因表达水平的变化,观察了大鼠发育成熟过程中心脏生长与心脏基因表达谱变化的关系。WWW.11665.COm结果显示,大鼠从8周龄生长至12周龄,体重增加约45.7%,前2周和后2周增加幅度相近；心脏左心室重量和室壁厚度分别增加约27.7%和23.6%,前2周增加幅度明显大于后2周；基因表达谱的改变涉及细胞结构、代谢、氧化应激及信号转导等多方面基因；10周龄和8周龄比较,变化的基因多数上调；12周龄和10周龄比较,基因表达谱基本又返转至8周龄水平。表明大鼠在成长期的4周内(8～12周龄),左心室基因表达谱发生的变化适应生理性心肌生长需要[5]。但由于这类报道较少,对大鼠出生后心脏生长发育的研究多为胚胎、新生、成年和老年之间的比较,且每位学者所研究基因不同,不能形成比较一致的心脏发育过程的基因表达谱,因而对这些问题的证实需要进一步的深入研究,进而确定心脏发育过程中的基因表达谱的变化及其意义。

　　2  不同病因所致心肌损伤重塑过程中的基因表达各异

    就目前文献研究分析,在心肌损伤重塑过程中,由于导致损伤的原因不同,各类基因表达存在明显不同,同时所筛选的基因类型和数量不同,导致心肌损伤的表达基因各异。

    张氏等[6]制备大鼠腹主动脉缩窄造成心脏肥厚模型,在缩窄2、4、6周3个阶段中,基因表达水平连续发生变化的基因较少,只有心钠素前体(anf)和几个est,而多数基因表达水平的变化仅出现在某一个特定阶段；2周后表达发生变化的基因相对较多,这些基因涉及的功能非常广泛,包括维持细胞结构、影响细胞代谢、介导细胞信号转导等,其中能改善血液纤溶状态的尿激酶、具有抗氧化功能的超氧化物歧化酶和参与心肌细胞脂肪酸β氧化的长链酰基辅酶a表达下降,心肌细胞骨架蛋白tnt2的表达也发生下调,而提示心脏纤维化的细胞外基质ⅰ型胶原和参与细胞增殖的转录因子p105表达升高；在4周和6周,上述基因表达水平的变化都恢复到正常水平,但又产生了新的基因表达改变,如在4周非心肌细胞骨架蛋白smooth muscle actin的表达上调,亚铁血红素氧化酶表达则下调,而在6周后pkc zeta、cyp450 iia3和脂肪酸氨基水解酶等基因的表达明显下调。同时,在通过缓释微泵连续输注去甲肾上腺素引起的心肌肥厚研究中,以参与能量代谢的肉毒碱八酰基转移酶、脂酶和糖原磷酸化酶为例,它们的表达变化模式较为相似,去甲肾上腺素输注早期其表达明显增高,而后逐渐下降,提示在心肌肥厚早期,心肌细胞通过增强脂肪酸代谢和抑制葡萄糖代谢来增加能量的产生,以适应高儿茶酚胺的病理性刺激,而心肌肥厚标志性基因心钠素前体的表达水平变化则与上述基因完全不同,其表达变化模式与心肌肥厚的进程一致,在心/体比达到最大时表达水平升至最高。此外,当心肌肥厚发展到最高峰时,参与信号转导和神经递质代谢的物质基因表达水平多发生变化,提示此时心肌细胞生物活动旺盛,以适应病理刺激。有在应用cdna基因芯片对安静对照组和运动性心肌肥大组小鼠心肌组织基因进行筛选,具有显著性表达差异的基因有71条,其中上调表达的基因37条,下调表达的基因34条。这些基因包括肿瘤相关基因、细胞骨架蛋白基因、代谢相关酶的基因、酪氨酸磷酸酶基因、心肌结构蛋白基因等多种多基因家族编码的基因,认为运动性肥大心肌是由多基因编码调控,并与细胞代谢、神经体液因素的调控以及心肌收缩蛋白和非收缩蛋白的合成共同参与有关,进一步证实了运动性心肌肥大相关基因的多样性[7]。以上结果反映出同样是心肌肥厚,基因表达情况大为不同。

    缺血、缺氧是烧伤、创伤、手术、休克等多种病理条件下组织细胞损害的基本原因之一,然而不同组织细胞对缺血、缺氧反应的敏感性不同。王氏等[8]探讨严重缺氧后心肌细胞损害敏感性的分子机制,其以包含4 096条小鼠基因的dna芯片,检测严重缺氧6 h的大鼠心肌和骨骼肌细胞之间的差异表达基因,结果显示,严重缺氧6 h后,125条基因在骨骼肌细胞中存在高表达,111条基因在心肌细胞中高表达,其中编码凋亡活化因子mtd、补体c3、血管细胞粘附分子-1(vcam-1)、β-整合素及脂多糖结合蛋白(lbp)等的基因在心肌细胞中高表达。表明严重缺氧6 h后,凋亡活化及炎症介质的产生在心肌细胞敏感性损害中发挥着重要作用。有比较正常大鼠和糖尿病性心肌病大鼠心肌组织中基因表达的差异,探讨糖尿病性心肌病的发病机制。结果显示：氧化应激相关基因和能量代谢相关基因的表达水平在糖尿病性心肌病时明显下调；s腺苷蛋氨酸合成酶和精氨酸酶的表达水平在糖尿病性心肌病时明显上调,说明氧化应激和能量代谢障碍在糖尿病性心肌病发病机制中起重要作用；s腺苷蛋氨酸合成酶、精氨酸酶通过影响糖尿病性心肌病大鼠心肌组织中同型半胱氨酸、一氧化氮的含量在糖尿病性心肌病发病机制中起重要作用[9]。华裔科学家、美国哈佛大学刘宗正教授宣布：他们已确定与心脏衰竭等心血管疾病有关的26 000多个基因,已经运用1万个左右与心血管疾病有关基因制成基因芯片,能够作为诊断心血管疾病的有力工具,但还需要进行更多的基因流行病学研究,才能找到特定疾病与基因间的关系。同时,由于心脏病的发生机率较高,并且引起心脏衰竭的病原较多,主要包括心肌炎、高血压、糖尿病、心肌梗死、缺氧等,现在虽然已经找到200多个与心脏衰竭有关基因,但需要进一步分析其与哪些病原有关[10]。

    可见,基因芯片技术筛选运动性心肌肥大相关基因具有高通量、高敏度、高效率、大规模和并行性等优点。可是,同是心肌损伤,由于病因不同,同时研究过程中所用的手段、所选基因及数量的不同,得出的特异性表达基因不同,在应用时较为困难,所以基因芯片技术在心血管病中的应用,仍需大力研究。

　　3  基因芯片技术在中医药防治心血管病基础研究中得以尝试

    基因芯片技术在中医药研究中,亦有从证的研究、复杂的作用机理研究、有效药物筛选及中药新药研发等进行了探讨,但多局限于研究思路和方法学探索上,具体研究中存在一些技术问题,理论和方法尚未成熟,仍处于摸索阶段[11]。目前,基因芯片技术在中医药治疗心血管病研究中的报道有限,王硕仁教授负责的课题组利用结扎大鼠左冠状动脉造成心肌梗死后心衰模型,对心衰形成期(术后10 d)、稳定期(术后8周)大鼠的左心室梗死区、非梗死区和同期假手术组的左心室分别取材进行了相关检测,并观察了益气活血复方的作用。发现心衰模型大鼠心肌有参与能量代谢、心肌细胞骨架及纤维等13类共1 000余条表达上调和下调的基因,在梗塞区差异表达基因形成期最多(1 086条)、稳定期次之(724条),而非梗死区为形成期最多(196条),稳定期较少(97条)。说明心肌梗死后心衰是一种多基因病,益气活血法可能通过对心肌梗死后心衰大鼠心脏能量代谢相关基因的调节而改善其功能,起到治疗心衰的作用[12]。此外,有学者制备了包含87个心血管疾病相关基因探针的寡核苷酸芯片,将知母皂苷作用8 h及未作用的培养人血管内皮细胞提取总rna,通过逆转录分别标记cy5和cy3荧光染料,然后与芯片杂交,检测知母皂苷对血管内皮细胞中心血管疾病相关基因表达的影响。结果显示,知母皂苷作用于血管内皮细胞后,血管紧张素酶原(agt)基因、肾上腺素α2a受体基因和内皮素转换酶1基因的表达均有不同程度的下调,说明知母皂苷有调控血管内皮细胞功能的作用,可能是其治疗心血管疾病的机制之一[13]。可见,基因芯片技术可以用于中药作用机理的研究,特别是其高通量、多态性等特点可能有助于解决中药作用多靶点的一些问题。但通过对已研究的资料进行分析,具体的基因调控、基因鉴定及其意义,应进一步深入分析与研究。

    综上所述,通过对近年来基因芯片技术在心血管病研究特别是国内的应用研究分析,存在一些问题,值得思考。如：①基因芯片的特异性有待提高。研究论文体现了多种原因均可使不同的大量基因上调或下调,但这些基因的特异性如何,有待进一步鉴定；②基因分析方法研究需要加强。如何利用好各种分析方法,进行对上调或下调基因进行分析,进而筛选出有价值的基因,是一份重要的工作；③正常动物及模型动物基因特异性表达研究有待加强。形成标准的基因谱,将对心血管病的诊断、治疗及药物筛选有重要意义。此外,对样品制备简单化、检测方法标准化等应进行深入研究,亦是今后研究的重点。相信不久的将来,基因芯片技术能够更好、更广泛地应用于心血管病的研究中。

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