【摘要】 目的 建立大豆类保健食品中黄豆黄苷和黄豆黄素的高效液相色谱含量测定方法。方法 色谱柱为agilent zorbax sb-c18(4.6 mm×150 mm,5 μm),流动相采用乙腈-0.2%甲酸进行梯度洗脱,检测波长为255 nm,流速为1 ml/min。结果 黄豆黄苷和黄豆黄素的线性范围分别为0.24～1.82 μg和0.040～0.30 μg；加样回收率分别为97.38% 和97.25%(n=5)。结论 本方法简便、灵敏、准确,可用于含大豆异黄酮类中药和保健食品中以上两种成分的含量测定和产品质量控制。
【关键词】 高效液相色谱法；黄豆黄苷；黄豆黄素；含量测定
abstract：objective to develop an hplc method for determination of glycitin and glycitein in functional foods simultaneously. methods an agilent zorbax sb-c18 column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) was applied. the gradient mobile phase composing of acetonitrile and 0.2% formic acid was used as the mobile phase, and the flow rate was 1.0 ml/min, detective wavelength was set at 255 nm. results the results were obtained that quantitative line range of two isoflavones is 0.24～1.82 μg and 0.040～0.30 μg respectively, and the average recovery (n=5) is 97.38% and 97.25% respectively. conclusion a specific, sensitive, simple and reproducible hplc method was established for the determination of the two isoflavones in functional foods.
key words：hplc；glycitein；glycitin；quantitative determination
大量研究表明,大豆异黄酮具有雌激素样作用,能降低乳腺癌、前列腺癌等疾病的发病率,缓解更年期因雌激素分泌减少而引起的停经期综合征和骨质疏松症,又有延缓衰老以及预防心血管疾病等多种功效[1-3]。WWw.11665.CoM大豆异黄酮类主要包括大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黄豆黄素和黄豆黄苷等成分。目前,大豆异黄酮类提取物和产品的质量控制多采用紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等测定其中部分异黄酮如大豆苷元、大豆苷、染料木素等的含量[4-8],但是对黄豆黄素和黄豆黄苷测定的报道很少。为更好地评价和控制产品的质量,我们建立了测定中药和保健食品中黄豆黄苷和黄豆黄素两含量的方法,并取得了满意的效果。
1 仪器与试剂
waters alliance 2690高效液相色谱仪,dad紫外检测器。黄豆黄苷和黄豆黄素对照品均由中国药品生物制品检定所提供。实验所用乙腈为色谱纯,其他溶剂为分析纯,水为纯净水,过millipoore 0.22 μm滤膜。含大豆异黄酮中药样品3个(样品1～3),保健食品样品3个(样品4～6)均为市售。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱agilent zorbax sb-c18(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱温25 ℃；流动相由0.2%甲酸-乙腈按梯度表组成(见表1),流速1 ml/min；检测波长255 nm；理论塔板数按染料木素计算不低于2 000。色谱图见图1。表1 流动相梯度表（略）
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取黄豆黄苷和黄豆黄素对照品适量,加甲醇分别配制成黄豆黄苷0.120 0 mg/ml和黄豆黄素0.020 1 mg/ml的溶液,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
分别取样品(市售含大豆异黄酮类保健食品和中药样品)细粉0.4 g,精密称定,精密加入甲醇25 ml,称定重量,超声处理30 min,放至室温,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,过0.45 μm的微孔滤膜,作为供试品溶液。
2.4 线性范围的考察
分别吸取对照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、15.0 μl,注入液相色谱仪,测定峰面积。以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,计算其回归方程。两种大豆异黄酮线性关系分别为：黄豆黄素y=6 863 452.35x+138 492.58(r=0.999 4),黄豆黄苷y=5 973 869.46x-24 952.48(r=0.999 7)。黄豆黄素和黄豆黄苷分别在0.040～0.30 μg和0.24～1.82 μg范围内线性关系良好。
2.5 稳定性试验
精密吸取供试品溶液10 μl,每隔2 h进样1次,共6次,测定峰面积,结果黄豆黄苷和黄豆黄素的rsd分别为1.04%和0.98%,表明12 h内测定结果稳定。
2.6 精密度试验
分别精密吸取对照品溶液10 μl,注入液相色谱仪,测定峰面积,结果黄豆黄苷和黄豆黄素的rsd分别为1.29%和1.73% (n=5),表明仪器精密度良好。
2.7 重复性试验
取同一样品5份,按样品处理方法平行提取并同法测定两种成分的含量,求出测得值的rsd。黄豆黄苷和黄豆黄素的rsd分别为1.13%和0.96%,表明本法重复性良好。
2.8 加样回收率试验
精密吸取已知含量的样品9份,每3份一组,按高、中、低3个水平分别精密加入一定量对照品,按“2.3”供试品溶液制备项下操作,两种成分的回收率分别为：黄豆黄苷97.38% (rsd=1.28%)、黄豆黄素97.25%(rsd=1.49%)。结果表明,以本法同时测定两种大豆异黄酮类成分,其回收率结果良好。
2.9 样品的测定
按“2.3”项下方法制备样品溶液并测定,6个品种大豆异黄酮类中药和保健食品样品的测定结果见表2。表2 不同样品中黄豆黄苷和黄豆黄素的含量(略)
3 讨论
本实验建立了中药和保健食品中黄豆黄苷和黄豆黄素的含量测定方法,从样品测定结果可以看出,不同产品所含的以上两种大豆异黄酮成分的含量差别很大,反映出目前市场上该类产品的质量良莠不齐的现状。
另外,含量测定方法学实验结果表明,本法操作简单,测定结果准确,具有良好的重复性,可用于含大豆异黄酮类成分中药和保健食品中黄豆黄苷和黄豆黄素的含量测定。
【参考文献】
[1] xu x, wang h, murphy pa, et al. neither background diet nor type of soy food affects short-term isoflavone bioavailability in women[j].j nutr,2000,130：798－801.
[2] adlercreutz h,mazur w.phyto-oestrogens and western diseases[j]. annals of medicine,1997,29：95－120.
[3] akiyama t, ishida j, nakagawa s, et al. genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases[j].journal of biological chemistry,1987,262：5592－5595.
[4] wang h, murphy pa. isoflavone composition of american and japanese soybeans in iowa：effects of variety, crop year, and location[j].journal of agricultural and food chemistry,1994,42：1674－1677.
[5] 孙梅君,骆 炼,史长颖,等.中国大豆制品中异黄酮含量测定分析研究[j].食品与发酵工业,1999,26(5)：14－18.
[6] song t, barua k, buseman g, et al. soy isoflavone analysis： quality control and a new internal standard[j].am j clin nutr, 1998,68：1474－1479.
[7] nakamura y, tsuji s, tonogai y. determination of the levels of isoflavonoids in soybeans and soy-derived foods and estimation of isoflavonoids in the japanese daily intake[j].j aoac int,2000, 83(3)：635－650.
[8] mellenthin o, galensa r. analysis of polyphenols using cap illary zone electrophoresis and hplc：detection of soy, lupin, and pea protein in meat products[j].j agric food chem,1999,47(2)： 594－602.
