作者：袁旭江，吴燕红，郭钟慧，谢琳，朱盛山，钟华林,李苑新
【摘要】 目的研究喉疾灵口含片的质量标准。方法 采用薄层色谱(tlc)法对喉疾灵口含片中人工牛黄、诃子、了哥王、冰片、桔梗进行定性鉴别;采用高效液相色谱(hplc)法进行苦参碱含量测定。结果 tlc法能分别检出喉疾灵口含片中人工牛黄、诃子、了哥王、冰片、桔梗，均具有良好的鉴别特征，阴性未见干扰;苦参碱在0.066 8～0.668 μg范围内，进样量与峰面积具有良好的线性关系， r=0.999 8，平均加样回收率为98.86%(n=6)，rsd=1.94%。 结论 本方法具有良好的专属性和重现性，能准确、稳定地对喉疾灵口含片进行定性鉴别和定量测定，可用于该制剂的质量控制。
【关键词】 喉疾灵口含片;tlc法;hplc法;苦参碱
abstract:objectiveto study on the quality standard of houjiling buccal tablets.methods thin layer chromatography (tlc) was used to identify calculus bovis artifactus,indian stringbush root,medicine terminalia fruit,borneol and balloonflower root,and hplc was applied to assay matrine.results calculus bovis artifactus,indian stringbush root,medicine terminalia fruit,borneol and balloonflower root can be identified by tlc without interference of negative samples.it showed a good linear relationship in determining matrine at the range of 0.066 8-0.668 μg, r=0.999 8,and the average recovery was 98.86%(rsd=194%).conclusion these methods can be used in qualitative identification and quantitative assay of houjiling buccal tablets with good specificity,reproducibility and stability.
key words:houjiling buccal tablets; tlc; hplc; matrine
喉疾灵口含片是由喉疾灵胶囊[1]经过提取精制和剂型改变而成，由人工牛黄、诃子(肉)、山豆根等12味中药材组成，具有清热、解毒、散肿止痛作用，用于腮腺炎、扁桃体炎、急性咽炎、慢性咽炎急性发作及一般喉痛等。WWw.11665.cOm为了更好控制喉疾灵口含片质量，保证其用药安全有效，笔者参照文献[2-5]对口含片中人工牛黄、诃子、了哥王、冰片、桔梗等进行了薄层色谱研究，建立其定性鉴别方法，并参照文献[6-9]采用高效液相色谱法建立该制剂主药山豆根所含主要有效成分苦参碱的含量测定方法，并对3批中试样品进行含量测定。现报道如下。
1仪器与试药
1.1仪器
agilent1100高效液相色谱仪系列(美国安捷伦公司)、bp211d电子分析天平(德国sartorius公司)、camag reprostar 3数码成像系统(瑞士camag)、h·s·g·ⅱb-4型电热恒温水浴锅(上海仪表供销公司)、kq3200超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司，功率120 w，频率40 khz)、硅胶 g预制板(浙江台州市路桥四甲生化塑料厂)，定量毛细管(drummond usa)。
1.2试药
喉疾灵口含片(批号：20070501、20070502、20070503)由陈李济药厂提供，苦参碱对照品(批号:110805-200306)、没食子酸对照品(批号：110831-200302)、人工牛黄对照药材(批号:121197-200502)、 桔梗对照药材(批号:121028-200507)、了哥王对照药材(批号:1266-0301)、冰片对照药材(批号:110742-200504)等均由中国药品生物制品检定所提供，水为三蒸水，其他试剂均为分析纯。
2定性鉴别
2.1人工牛黄tlc鉴别
取本品6片，研细，称取2.4 g，加甲醇10 ml，超声处理10 min，滤过，滤液浓缩至2 ml，作为供试品溶液。取人工牛黄对照药材，加甲醇使溶解，制成每1 ml含10 mg的溶液，作为对照药材溶液。另按处方工艺制备缺人工牛黄的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。按《中国药典》2005年版一部附录ⅵb 薄层色谱法试验，精密吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比9∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%(体积分数)硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。阴性对照则未见相应斑点。见图1。
2.2了哥王tlc鉴别
取“2.1”项下供试品溶液作为供试品溶液。分别取了哥王原药材、了哥王对照药材各0.5 g，同供试品溶液制备方法制备了哥王原药材及对照药材溶液。另按处方工艺制备缺了哥王的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。按《中国药典》2005年版一部附录ⅵb薄层色谱法试验，精密吸取上述4种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(体积比6∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材、原药材色谱相应的位置上，显蓝色荧光斑点。阴性对照则未见相应斑点。见图2。[psd171;s*2〗1.人工牛黄对照药材; 2～4.供试品; 5.阴性对照图1人工牛黄tlc图figure 1tlc chromatogram of calculus bovis artifactus[psd172;s*2〗1.了哥王对照药材; 2.了哥王原药材; 3～5.供试品;6.阴性对照图2了哥王tlc图figure 2tlc chromatogram of indian stringbush root
2.3诃子tlc鉴别
取“2.1”项下供试品溶液作为供试品溶液。取诃子肉原药材0.5 g，同供试品溶液制备方法制备原药材溶液。取没食子酸对照品适量，加乙醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。另按处方工艺制备缺诃子肉的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。按《中国药典》2005年版一部附录ⅵb薄层色谱法试验，精密吸取上述4种溶液各3 μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(体积比7∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%(质量浓度)三氯化铁乙醇溶液，置可见光下检视。供试品色谱中，在与对照品、原药材相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性样品则无相应斑点。见图3。[psd173〗1.没食子酸对照品;2.诃子原药材;3～5.供试品;6.阴性对照图3诃子tlc图figure 3tlc chromatogram of medicine terminalia fruit
2.4冰片tlc鉴别
取本品10片，研细，过100目筛，称取粉末3 g，用无水乙醚振摇洗涤5次，每次20 ml，弃去乙醚液，残渣挥干乙醚，加甲醇20 ml超声处理10 min，滤过，滤液蒸干，用乙酸乙酯20 ml超声溶解，滤过，滤液蒸干，加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取冰片对照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。另按处方工艺制备缺冰片的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。按《中国药典》2005年版一部附录ⅵb 薄层色谱法试验，精密吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(体积比10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%(质量浓度)磷钼酸无水乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置可见光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照未见对应斑点。见图4。[psd174;s*2〗1.冰片对照品; 2～4.供试品; 5.阴性对照 图4冰片tlc图figure 4tlc chromatogram of borneol
2.5桔梗tlc鉴别
取本品10片，研细，称取5 g，加7%(体积分数)硫酸乙醇-水(体积比1∶3)混合液20 ml，加热回流提取3 h，放冷，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷液，加水30 ml洗涤，弃去洗涤液，三氯甲烷液用无水na2so4脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。取桔梗对照药材1.5 g，同法制备对照药材溶液。另按处方工艺制备缺桔梗的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。按《中国药典》2005年版一部附录ⅵb 薄层色谱法试验，精密吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-冰乙酸-水(体积比1.5∶1.5∶1∶1)上层液为展开剂，饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以10%(体积分数)硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置可见光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的的斑点。阴性样品则未见相应斑点。结果见图5。[psd175;s*2〗1.桔梗对照药材; 2～4.供试品; 5.阴性对照图5桔梗tlc图figure 5tlc chromatogram of balloonflower root
3含量测定
参考相关文献[6-9]，建立了喉疾灵口含片中苦参碱的含量测定方法。
3.1色谱条件
色谱柱：agilent c18 (4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相：0.4%(体积分数)三乙胺乙腈-0.2%(体积分数)磷酸水溶液(体积比7∶93);检测波长：202 nm;流速：0.5 ml·min -1。
3.2对照品溶液的制备
精密称取苦参碱对照品适量，置量瓶中，加水使完全溶解，制成每1 ml中含苦参碱66.8 μg的溶液，作为对照品溶液。
3.3供试品溶液的制备
取本品10片，研细，取约2 g,精密称定，精密加入稀氨水(1→10)25 ml，称定质量，超声处理30 min使溶解，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 ml，置中性氧化铝柱(100～200目，5 g，内径1 cm)上，用氨水饱和的乙酸乙酯50 ml洗脱。收集全部洗脱液，蒸干，残渣用无水乙醇1 ml超声溶解，再用少量水超声洗涤多次，全部合并置5 ml量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
3.4缺山豆根阴性对照溶液的制备
按处方工艺制备缺山豆根阴性样品，称取2 g，按“3.3”项下方法制备，即得。
3.5系统适应性试验
分别精密吸取对照品、供试品、缺山豆根阴性对照溶液各10 μl，按“3.1”项条件进样。在该色谱条件下，苦参碱与其他成分可达基线分离，苦参碱保留时间约为6.7 min，理论塔板数不低于3 000，各成分分离度均大于1.5;阴性对照无干扰。见图6。[psd176;s1〗a.苦参碱对照品; b.供试品; c.缺山豆根阴性对照图6苦参碱的hplc图figure 6hplc chromatograms of matrine
3.6方法学考察
3.6.1线性范围的考察分别精密吸取苦参碱对照品溶液 1、2、4、8、10 μl依次进样，按“3.1”项下条件测定峰面积，以苦参碱进样量(x)对峰面积(y)进行线性回归，得回归方程为y=4.2205×10-3x+22.697，r=0.999 8。结果显示，苦参碱进样量在0.066 8～0.668 μg范围内与峰面积有良好的线性关系。
3.6.2精密度试验精密吸取供试品溶液(20070501)10 μl，连续测定6次，测定峰面积，计算含量。结果苦参碱平均质量分数为0.579 9 mg·g-1，rsd为0.13%，表明仪器精密度良好。
3.6.3稳定性试验精密吸取同一批号(20070501) 供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件，分别于0、5、6.5、8、9、12 h 进样10 μl，测定峰面积，计算含量。结果苦参碱平均质量分数为0.579 0 mg·g-1，rsd为0.27%，表明苦参碱在12 h内稳定。
3.6.4重复性试验取同一批样品(20070501)按“3.3”项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，按“3.1”项下色谱条件，测定峰面积并计算含量。结果苦参碱平均质量分数为0.576 4 mg·g-1，rsd为1.31%，表明重复性良好。
3.6.5加样回收率试验取已知含量的同一批号(20070501)喉疾灵口含片(约相当于苦参碱0.574 0 mg·g-1)适量，研细，取6份，每份约1 g，精密称定，分别置25 ml量瓶中，再分别加入苦参碱质量分数为1.022 mg·ml-1对照品溶液(精密称取苦参碱对照品5.11 mg，置5 ml量瓶中，加水使完全溶解并定容至刻度)0.5 ml，按“3.3”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件测定，计算苦参碱回收率，见表1。
3.7样品含量测定
取3批中试样品(20070501、20070502、20070503)，分别按照“3.3”项下方法制备供试品溶液，每批平行操作3份。分别精密吸取各供试品溶液10 μl，注入高效液相色谱仪，按“3.1”项下条件测定，计算苦参碱含量。结果3批中试样品中苦参碱含量分别为0.357 4、0.420 7、0.383 6 mg·片-1。
4讨论
4.1定性鉴别中药材的选择
在原喉疾灵胶囊(国家部颁标准，标准编号：ws3—b—1039—91)和喉疾灵片(部颁标准，标准编号：ws3—b—2797—97)质量标准基础上结合《中国药典》2005年版一部中相关药材标准，对喉疾灵口含片进行了系统研究，旨在提高其质量标准。本研究用无毒或低毒溶剂替换毒性较大的溶剂，如用二氯甲烷替换三氯甲烷等，可提高试验安全性。方中人工牛黄、了哥王、冰片、桔梗、诃子的tlc鉴别均具有明显的特征斑点，且阴性未见干扰;而连翘、天花粉、猪牙皂、板蓝根等药材虽具相应的鉴别特征，但重现性均较差，故暂未列入质量标准，拟在下一步试验中进行研究。山豆根药材虽也有专属鉴别特征，但其所含特征性成分苦参碱已列入定量检测项中，故不选作定性鉴别。表1加样回收率试验结果
4.2含量测定指标的确定
方中山豆根为主药，具有清热解毒、利咽散肿作用[2]，苦参碱、氧化苦参碱为其主要有效成分。本方中山豆根采用水提工艺，氧化苦参碱经水煎煮后转化为苦参碱[6-7]，故本文只选择了苦参碱作为喉疾灵口含片质量控制的指标成分进行定量研究。
4.3色谱条件的选择
对乙腈-水、乙腈-0.2%(体积分数)磷酸水、04%(体积分数)三乙胺乙腈-水和0.4%(体积分数)三乙胺乙腈-0.2%(体积分数)磷酸水等流动相及其不同配比进行了比较，结果以0.4%(体积分数)三乙胺乙腈-0.2%(体积分数)磷酸水溶液(体积比7∶93)进行洗脱的分析效果较优，分析时间短、分离度较高、基线较平稳，适用于该制剂的含量分析。
本文所建立的人工牛黄、了哥王、冰片、桔梗、诃子tlc法均具有良好的专属性和重现性，可用于喉疾灵口含片的药材定性鉴别;所建立的含量测定方法具有良好的精密度、准确性和重复性，专属性好，测定快速，可用于喉疾灵口含片中苦参碱的含量测定。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.ws3—b—1039—91.中华人民共和国卫生部颁药品标准(中药成方制剂第五册)[s].北京:中华人民共和国卫生部,1992:177.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部 [m].北京:化学工业出版社,2005:19,48,99,129,196.
[3] 林小玲.喉疾灵胶囊薄层色谱鉴别[j].时珍国医国药,2000,11(12):1104.
[4] 丁岗,陆蕴如,冀春茹,等.诃子的薄层色谱鉴别[j].北京中医药大学学报,2001,24(1):45.
[5] 石林平,姚立娟.复方桔梗止咳滴丸的制备和质量标准研究[j].中草药,1999,30(12):907-908.
[6] 崔健,耿惠,刘淑杰,等.山豆根在复方中化学成分变化的研究[j].中草药,2001,32(7):613-614.
[7] 丁佩兰,郁韵秋,王钢力,等.rp-hplc法评价山豆根药材质量[j].复旦学报:医学版,2004,31(2):208-210.
[8] 马长华,曹天海.hplc法测定山豆根中苦参碱和氧化苦参碱的含量[j].药物分析杂志,2000,20(6):408-409.
[9] 黄际薇,曲彩红,庄华玲,等.山豆根煎煮工艺的优选试验[j].中药材,2005,28(4):339.
