作者：陈连水，张浩，袁凤辉，毛月祥，曹宁，朱茫
【摘要】 目的了解掌握悦目金蛛生活习性和形态特征，分析毒腺形态与体量的相关性，优化明确制毒路线，获得较纯生理活性较高的蜘蛛粗毒。方法通过毒腺形态解剖，借助数理统计方法分析了毒腺形态与蜘蛛体量的相关性；采用毒腺解剖法直接获取性质稳定和最多量的蛛毒粗品，以鸡红细胞为模型检验了粗毒效价，探索了毒素离子通道抑制类型。结果毒腺重量与体量呈正相关，按照优化后的制备方法和技术线路，制得5 mg悦目金蛛粗毒；悦目金蛛毒素有促进红细胞凝集和裂解作用，在钙离子环境下毒素对红细胞的裂解作用更强。结论利用毒腺解剖法能够获得最大量更高纯度的蛛毒，初步确定了蛛毒当中含有凝集素和磷脂酶两种成分。
【关键词】 悦目金蛛； 毒腺解剖； 粗毒 ； 细胞毒理
chinaabstract：objectivehaving a detailed mastery about the argiope amoena' s morphological characteristics and living habits, we analyzed the relevence of poison gland weight and length to its body. using the optimized method we obtained higher biological properties and more pure venom. methods we got the relevence of poison gland weight and length to its body using statistical method by anatoming poison gland. isolating poison gland from spider, obtained stable and maximum amount of venom， we tested titer of venom and explore the type of inhibit ion channels toxin using chicken red blood cells as a model. results venom gland' s weight and body mass were positively correlated. with the optimized mean prepared method, five millingrams of crude venom were got. the venom has effect of promoting red blood cell aggregating and cracking. the blood cell cracked more seriously in the calcium ions environment. conclusion more qualified venom can be got by venom gland dissection. we initially know that venom contains phospholipase lectin and agglutinin.
key words：argiope amoena; anatomy of venom; crude toxin; cell physiology
蜘蛛是害虫的重要天敌，以其毒素麻痹杀死猎物。wwW.11665.cOm蜘蛛毒素成分复杂，主要为蛋白质和多胺类物质，蛋白质包括各种多肽神经毒素、细胞毒素、酶、激肽类似物、凝集活性肽和抗菌肽等，多胺类物质有atp、核苷酸、氨基酸、多胺、单胺类等低分子量物质和无机盐等。蜘蛛毒素具有多种活性，现已证实含有多种特异性多肽配体，可以选择性地和k+、na+、 ca2+ 通道的亚型相结合［1～11］。国内梁宋平等［12］对虎纹捕鸟蛛、海南捕鸟蛛和广西大疣蛛的毒素进行了较深入的研究。悦目金蛛argiope amoena隶属于蜘蛛目园蛛科金蛛属，体中大型，为结网蜘蛛，在我国南方各省均有分布，多出没于夏秋季，以卵袋越冬［13］。由于悦目金蛛多生活在植被繁茂的山区，不易饲养，故关于悦目金蛛毒素的研究少有报道。
1 仪器与材料
1.1 仪器
上海精密a1004电子天平，olympus cx41显微摄像系统，上海新苗dnp-9052bs-ⅲ电热恒温培养箱和dhg-9073bs-ⅲ恒温鼓风干燥箱，湖南星科tgl-16b台式高速离心机，江苏昆山kq-50db数控超声波清洗器，北京泰克0610-403体式显微镜，日本三丰560-108 nk20游标卡尺，上海光学显微镜测微尺和上海亚荣真空抽气泵与干燥器等。
1.2 悦目金蛛的采集
悦目金蛛采自于江西省贵溪市冷水林场，共28头，其中雄性3头，雌性25头。悦目金蛛主要分布于山区丘陵地带，布圆网于向阳面，以捕食较大型昆虫为主，喜结网于人居区周边灌丛，尤以牛棚猪圈旁为多。悦目金蛛脆弱，附肢较长，极易损伤，在采集过程当中应格外小心；可以用捕虫网将蜘蛛捕获，装入盒内，放入一些树叶，以保持湿度和良好通风性，避免振荡和过度高温。采集完毕返回后，应将蜘蛛及时放在灌木上实行半开放式生态放养。
2 结果与方法
2.1 悦目金蛛毒腺形态与体量相关性分析
悦目金蛛的毒腺最细端位于螯基前端，并向头部延伸，多位于头胸部前段内，覆盖在神经团上，且左右两两相对趋向于蛛体的纵中轴。为了快速、准确而高效地获得蜘蛛毒腺，避免造成材料的损失，我们对悦目金蛛毒腺进行了形态解剖，明确毒腺的结构和具体位置，然后对毒腺进行形态描述。解剖之前先用电子天平称出蜘蛛的体重, 对大型个体用游标卡尺分别量出其头胸部和腹部的长和宽, 而对小型蜘蛛个体则用显微测微尺量出其头胸部和腹部的长和宽，随后测量取出的毒腺长和宽，并称重。
具体测量结果见表1～2，对数据进行回归分析表明：悦目金蛛在性别相同、生境一致、个体大小不同时，蜘蛛毒腺的位置和形态与蜘蛛的种群演化、生活方式和形态体积有一定关系，其中，成蛛的毒腺重量与其体质量之间呈正相关，相关显著；成体的毒腺长度与其头胸长之间也为正相关，显著性检验为极显著。表1 悦目金蛛成体毒腺重量与个体质量的相关性（略）表2 悦目金蛛成体毒腺长度和个体长度的数据相关性分析（略）
2.2 悦目金蛛粗毒提取和制备方法的优化
由于悦目金蛛与特大型虎纹捕鸟蛛、敬钊缨毛蛛等相比，成体相对较小，含毒量不多，且附肢长，给采毒带来困难；我们在尝试过活体诱导取毒、电刺激取毒和解剖分离毒腺等多种方法后，确定了采用毒腺解剖法，后经多次比对试验，优化出一条适于毒量不大蜘蛛毒腺的解剖匀浆取毒法，步骤如下：
先将蜘蛛放入冰箱-4℃冻晕，根据鳌肢确定毒腺管位置，然后从背面“丁字型”剪开其头胸甲，依毒腺管向上延伸方向找到毒腺，并用镊子小心取出，将其冰冻干燥保存。
取15对干燥毒腺，在2～3倍去离子水中制成匀浆，用2 000 r/min的速率离心15 min，取上清液。向沉淀物中加等体积去离子水，再离心，取上清液。再向沉淀物中加等体积去离子水，调ph 值至4.0，匀浆、离心、取上清液，合并上清液，过滤，去除杂质，得到澄清液，进行冷冻，等结成冰块，将冷冻的蛛毒冰块放置于真空干燥器内，进行真空干燥，在干燥器的底层放适量的氧化钙作为干燥剂，接着用真空泵抽气，抽气过程中，要注意观察，如果发现蛛毒表面产生大量气泡时，就要停止片刻再抽，直至基本干燥，变成大小不等的颗粒结晶体为止，真空干燥一般在6 h内彻底干燥完。干燥后的蛛毒即成粉末状或块状，刮下干毒粉分装成小瓶，溶蜡密封，贴上标签，注明蛛毒毒粉的制备日期和重量，上包不透明的黑纸，置于-５℃的冰箱内可保存1年不变质。在整个取毒和制备过程中，应首先注意整个过程必须洁净卫生，确保采毒的纯度，其次取毒过程尽量在低温下进行，各种试剂必须预先冰浴。
2.3 悦目金蛛粗毒组分和效价检测
2.3.1 悦目金蛛粗毒组分及结构观察
常温下，提取制备到的悦目金蛛粗毒呈粉状；用光学显微镜观察粗毒，100和400倍下粗毒呈片状或片状均匀晶体，不含其它颗粒杂质。见图1。
2.3.2 悦目金蛛粗毒的凝聚和裂解作用检测
取50 μl制备好的泰和乌鸡血红细胞悬液（悬液细胞密度约为1.04×103 个/mm3）和200 μl pbs缓冲液加入1 ml的pvc离心管中，随后加入50 μl悦目金蛛毒液，振荡，摇匀。竖置于30℃的恒温培养箱中，每隔5 min，用移液枪取20 μl反应液于单凹载玻片上，用显微镜观察，并拍照。经多次重复梯度实验，结果表明悦目金蛛粗毒溶液对泰和乌鸡血红细胞有明显的促凝集和裂解作用，由此可说明粗毒中含有糖蛋白凝集素和磷酯酶成分，且它能介导红细胞粘连和促进细胞裂解。见图2。
2.3.3 悦目金蛛粗毒促离子通道成分的探索
分别在60 μl制备好泰和乌鸡血红细胞悬液（悬液细胞密度约为1.04×103 个/mm3）中加入相应的0.17 mol/l kcl和0.17 mol/l cacl2溶液，调配至1.5 ml，分成3个对照组，前两份分别加入20 μl悦目金蛛毒液和20 μl大腹园蛛毒液，另外一份加入20 μl pbs缓冲液。设5 min，30 min，60 min，120 min和180 min 5个不同反应时段，分段取液于血球计数板上，用显微镜观察并计数。具体反应结果见图3～4。通过对图的比对分析，可以得知：悦目金蛛毒素和大腹园蛛毒素均有促进红细胞溶血的作用，且大腹园蛛毒素的作用更为明显。而且，毒素对红细胞的裂解作用在钙离子环境下要比钾离子环境下更强。推测其原因可能是两种粗毒中有钙离子配体门通道的激活成分，致使钙离子快速进入红细胞，加速溶血；另外，蛛毒中可能存在的磷脂酶裂解红细胞质膜也是其中原因之一。
3 讨论
目前，蛛毒的采集多为诱导法和电击法，由于悦目金蛛个体相对较小，螯肢细短，活体采毒极为困难。本文在对悦目金蛛的生活习性和形态结构进行初步研究的基础上，用改良优化的毒腺解剖匀浆法，成功提取制备了具有稳定性质和生理活性的粗毒5 mg，为毒素的后续纯化和研究奠定了基础。后续实验表明，利用毒腺解剖匀浆法能够获得最大量更高纯度的蛛毒。在实体镜下，用解剖剪剪开螯肢和头胸甲取出毒囊，如用银针刺破毒囊，而不用匀浆法，可进一步避免非毒素蛋白的污染。用去离子水将毒液洗出，2 000 r/min离心15 min取上清液，冷冻干燥，获得的毒素在显微镜下可观察到均匀的结晶体。通过蛛毒对鸡血红细胞的毒理反应研究，初步确定了蛛毒当中含有凝集素和磷脂酶两种成分。除此之外，还发现在钙离子环境下蛛毒对红细胞的溶血和凝集作用更为剧烈，其原因可能是蛛毒中含有某种物质作用于细胞质膜上的钙离子配体门通道，从而促使钙离子快速进入红细胞导致细胞膨胀溶血，或许蛛毒中的凝集素也是某种类钙粘蛋白，在钙离子激活后能促使红细胞粘连或凝集，降低o2/co2交换率，造成机体呼吸窘迫甚至死亡。
【参考文献】
1］袁凤辉,白 涛,曹 波,等.蜘蛛的药用价值研究概况［j］.时珍国医国药，2008,19(2):282.
［2］费 瑞,杨 洋.蜘蛛毒素的研究概况及应用［j］.吉林大学学报，2004,30(6):994.
［3］王建辉,谷维娜.蜘蛛多肽毒素研究进展［j］.蛛形学报，2002,11(2):99.
［4］罗育发,颜亨梅.蜘蛛毒腺解剖的初步研究［j］.激光生物学报，2003,12(2):132.
［5］黄仁槐,梁宋平.蜘蛛多肽神经毒素研究新进展［j］.生命科学研究，2000,4(2):1.
［6］malcolm r.brown,david d.sheumack.amino acid sequence of versutoxin,a lethal neurotoxin from the venom of the funnel-web spider atrax versutus［j］.biochem.j.1988,250:401.
［7］gray,m.r. sutherland,s.k. arthropod venoms. springer-verlag,berlin.1978：pp.121.
［8］andré junqueira zaharenko, wilson alves ferreira .proteomics of the neurotoxic fraction from the sea anemone bunodosoma cangicum venom :novel peptides belonging to new classes of toxins. joacir stolarz oliveira, michael richardson, 2008, 3（3）：219.
［9］kristian strmgaard , ian mellor .ampa receptor ligands:synthetic and pharmacological studies of polyamines and polyamine toxins［j］.medicinal research reviews.march 2006,24（5）：589.
［10］glenn f. king, margaret c. gentz, pierre escoubas, et al. a rational nomenclature for naming peptide toxins from spiders and other venomous animals［j］. toxicon,2008,52(2):264.
［11］helmut kubista, roberta a. mafra, youmie chong. cstx-1, a toxin from the venom of the hunting spider cupiennius salei, is a selective blocker of l-type calcium channels in mammalian neurons［j］.neuropharmacology, 2007，52(8):1650.
［12］梁宋平.虎纹捕鸟蛛毒的生物学活性鉴定［j］.动物学研究,1993,14(1):60.
［13］卓春晖.悦目金蛛argiope amoena若蛛生态学特性观察及悦目金蛛蛛网结构、拖牵丝力学性能研究［d］.硕士论文:四川大学生命科学院,2007.
