作者：刘婷，厍文波，王婷，付伟，郑秋生，李刚，马成俊，王振华
【摘要】 目的采用水蒸气蒸馏和二氧化碳超临界萃取方法提取薰衣草精油，比较其体外抗氧化作用。方法通过dpph、羟自由基、超氧阴离子、脂质过氧化及溶血反应体系，检测并比较两种方法提取的薰衣草精油抗氧化能力。结果两种方法提取的薰衣草精油均具有较强抗氧化能力，且呈剂量依赖性。在5个氧化体系中，超临界co2萃取法提取的薰衣草精油抗氧化作用均强于水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油。结论超临界co2萃取法提取的薰衣草精油具有更强的抗氧化能力。
【关键词】 薰衣草精油； 抗氧化； 水蒸气蒸馏法； 超临界co2萃取法
abstract：objectiveto withdraw lavender oil with different methods and compare their antioxidative activities in vitro. methods the lavender oil was extracted through steam distillation method and supercritical co2 extraction method. the antioxidative capacity of lavender oil was examined through dpph, hydroxy radical, superoxide anion,lipid peroxidation and hemolysis reacting system. resultsboth of the lavender oils by different extraction method had strong antioxidative capacity in concentration-dependent manner. while the lavender oil extracted by supercritical co2 extraction was more efficacious than the one extracted by steam distillation method. conclusionthe lavender oil which was extracted through co2 extraction method has better antioxidation capacity.
key words： lavender oil； antioxidative； steam distillation method； supercritical co2 extraction method
随着人们生活水平的提高，消费观念的改变，人们越来越担忧化学合成香精的安全性，对天然植物精油的需求量不断增加。wwW.11665.COm
精油也称挥发油是一类可随水蒸气蒸馏的油状液体，芳香而有辛辣味，存在于植物的根、茎、叶、花、果实中，具有广泛的生物活性，临床上主要用于止咳、平喘、发汗、祛痰等。水蒸气蒸馏法是最常用的精油提取方法，不仅收率低，而且由于芳香性成分的大量损失及某些成分的分解变化而使最终产品质量较差［1］。超临界萃取技术(supercritical fluid extraction，sfe)是近二三十年发展起来的一种新型提取技术，它综合了溶剂萃取和蒸馏两种功能的特点［2］。尽管精油所含化学成分因其来源不同而颇不一致，但因其沸点较低，分子量不大，在超临界co2中有良好的溶解性能，大多数都可用纯co2直接萃取得到，所需的操作温度一般较低，避免了其中有效成分的破坏或分解，因此不仅产品质量佳，而且回收率也较水蒸气蒸馏法高得多［1］。
薰衣草（lavender）系唇形科薰衣草属（lavandula）植物，为多年生亚灌木［3］，原产于地中海地区，后移植世界各地，新疆现有大量栽培。薰衣草首载于阿维森纳著《医典》中［4］，维吾尔医用于治胸腹胀满、感冒咳喘、头晕头痛、心悸气短、关节骨痛，为中华人民共和国卫生部《药品标准》维吾尔药分册的收载品种［5］。薰衣草叶、茎、花全株呈浓香，香味浓郁而柔和，无刺激感、无毒副作用，被广泛地应用于医药、化妆、洗涤、食品行业［6］。
从薰衣草中提取的植物油含有多种芳香族化合物，是重要的天然香料。薰衣草中精油含量较高，因其气味芳香，常用作芳香剂、驱虫剂及配制香精的原料。提取薰衣草精油通常采用水蒸气蒸馏法，也可以用溶剂法制成浸膏。水蒸气蒸馏法的得率比较低，溶剂法不仅需要去除浸取溶剂，还会使产品中残留溶剂及所含有的化学物质。而采用超临界co2萃取技术提取薰衣草精油还未得到广泛的应用。
近年来，随着薰衣草应用范围的扩大，国内外许多研究人员对其进行了多方面的研究，研究内容涉及薰衣草的栽培措施、薰衣草精油的提取、化学成分分析及应用。但通过体外抗氧化实验比较水蒸气蒸馏法和超临界co2萃取法提取的薰衣草精油抗氧化活性差异，尚未见相关文献报道。本文旨在为推广超临界co2萃取技术和深入研究薰衣草精油药理作用奠定基础。
1 仪器及材料
超临界co2萃取仪（南通华安超临界萃取设备有限公司）；多功能酶标仪（thermo 3001 varioskan flash）；ar-2140型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司制造）。薰衣草花（新疆农四师六十三团）；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（sigma公司）；tris(北京拜尔迪生物公司)；2-硫代巴比妥酸（上海科丰化学试剂有限公司）；焦性没食子酸（天津市富宇精细化工有限公司）；氢过氧化枯烯（sigma公司）。
2 方法
2.1 薰衣草精油的制备
2.1.1 水蒸气蒸馏法提取
精油称取80 g薰衣草花穗粉末，浸泡1 h后，置于1 000 ml三口烧瓶中，一口连接水蒸气发生装置，另一口连接直型冷凝管，冷凝管接油水分离器。水蒸气通入烧瓶，从有馏出液滴出开始计时，通过油水分离器分出下层水分，3 h后停止蒸馏，收集精油。将数次实验所得精油合并，加入无水na2so4 除去水分后称量并计算得率，冷藏。
2.1.2 超临界co2萃取法提取
精油薰衣草花穗粉末装入萃取罐中，在解析压力为6.5×103 kpa,萃取压力为22×103 kpa ,温度为45 ℃，以20 l/h的流量通入co2，萃取120 min后，从解析罐中放出精油。 将数次实验所得精油合并，称量并计算得率，冷藏。
2.1.3 薰衣草精油得率的计算
薰衣草精油得率（%）=［萃取出的薰衣草精油质量（g）］/［原料质量(g)］×100%
2.2 dpph·清除能力测定
向100 μl dpph·乙醇溶液（浓度为0.1 mmol/l）中加入不同浓度的薰衣草精油及无水乙醇使总体积达到200 μl。振荡器混匀后，室温，避光放置30 min后，在517 nm处测定吸光度，平行测定3 次，计算清除率。
dpph·清除率（%）=［a0-（a1-a2）］/a0×100%
式中：a0为dpph·溶液100 μl加无水乙醇100 μl的吸光度；
a1为dpph·溶液100 μl加样品溶液100 μl的吸光度；
a2为样品溶液100 μl加无水乙醇100 μl的吸光度。
公式中引入a2是为了消除样品溶液本身颜色对实验测定的干扰。
2.3 ·oh清除能力测定
损伤管：30 μl 0.75 mmol/l邻二氮菲无水溶液中加入60 μl 0.15 m的pbs（ph=7.4），加入30 μl的蒸馏水，充分混匀后，加入30 μl 0.75 mmol/l的硫酸亚铁，混匀后，再加入30 μl的1%的h2o2混匀。37℃的水浴中60 min后，在536 nm处，测定吸光度为a损；未损伤管：以30 μl的蒸馏水代替h2o2重复上述操作，在536 nm处，测定吸光度为a未损；样品管：以30 μl的样品代替30 μl的蒸馏水重复损伤管组操作，在536 nm处，测定吸光度为a样；样品参比：60 μl 0.15 mol/l的pbs中加30 μl的样品，充分混匀后，加入90 μl的蒸馏水，在536 nm处测定吸光度为a参；空白参比：60 μl 0.15 mol/l的pbs加入120 μl的蒸馏水，在536 nm处测定吸光度为a空。
·oh清除率（%）=［（a样-a参-a损+a空）/（a未损- a损）］×100%
2.4 超氧阴离子生成抑制能力测定
取浓度为0.05 mol/l的tris-hcl（ph=8.2）缓冲液100 μl，25 ℃预热20 min后，加入 50 μl不同浓度的薰衣草精油，立即加入40 μl的3 mmol/l的邻苯三酚，振荡使之充分反应，4 min后，用10 μl的3 mol/l的hcl终止反应，在325 nm处测定吸光度（a1），平行测定3次。模型对照组（a0）用50 μl的蒸馏水代替样品液。空白对照组（a2）用40 μl的蒸馏水代替邻苯三酚。
o-2· 抑制率（%）=［（a0-a1+ a2）/a0］×100%
2.5 卵黄脂质过氧化抑制能力测定
卵黄悬液的配制：卵黄用等体积的ph=7.4的0.1 m pbs配成1∶1悬液，并用磁力搅拌器搅拌10 min（置于冰箱中4℃）备用，使用前用pbs稀释成1∶25的悬液。吸取1∶25的卵黄悬液20 μl,加入20 μl的不用浓度的薰衣草精油，再加入20 μl的25 mmol/l的feso4，用ph=7.4，0.1 mol/l的pbs补至200 μl,37℃振荡15 min，取出后再加入50 μl的20%的三氯乙酸，4 000 r/min离心8 min，吸取100 μl上清液加入50 μl 0.8% tba，封口，沸水浴中煮15 min，在532 nm处测吸光度，平行测定3次。以不加样品管的吸光度为a0。以样品加pbs管的吸光度为a样。
抑制率(%)=［（a0-a+a样）/a0］×100%
2.6 红细胞溶血实验
取新鲜大鼠血液，加入备有肝素钠的离心管中，制成抗凝血，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，用pbs（ph=7.4) 洗涤，3 000 r/min离心10 min，重复2次，得到压积红细胞，以pbs（ph=7.4）将压积红细胞配成2.5%混悬液。各取100 μl2.5%红细胞悬液，加入不同浓度样品溶液50 μl，加入100 μl的0.5 mmol/l氢过氧化枯烯，37 ℃温孵3.5 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液测定od710(a)；取100 μl的红细胞加50 μl的pbs,100 μl的蒸馏水，作为完全溶血的对照，同样处理，测定 od710 (b)。按公式 (a/b) ×100 %计算溶血的变化。
2.7 统计分析
所有数据用±s表示，采用spss 10.0软件包，进行单因素方差分析及t检验。
3 结果
3.1 薰衣草精油的外观状态与得率水蒸气蒸馏法制备的薰衣草精油为微黄色澄清油状液体，香气柔和，得率在0.7%～0.9%。超临界co2萃取法制备的薰衣草精油为深黄色微浑浊油状液体，香气较浓烈，近似真花香，得率在3.1%～4.2%。
3.2 dpph·清除能力测定人工合成的dpph是少数化学性质稳定的自由基之一，其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm附近有强吸收峰。当dpph·溶液中加入自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系。因而可用比色法进行定量分析，评价样品的抗氧化能力［7］。如图1所示，两种方法提取的薰衣草精油都有一定的清除dpph能力，清除率随着提取物浓度的增加而增高。在相同的浓度下，超临界co2萃取法提取的薰衣草精油清除dpph·的能力强于水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油，差异有统计学意义（p＜0.01）。
3.3 ·oh清除能力测定fenton反应产生的羟自由基使邻二氮菲吸光度降低，清除剂清除·oh，吸光度升高，利用反应前后吸光度值a的变化来测定清除率。从图2可得知，两种方法提取的薰衣草精油具有一定的清除·oh的能力，且呈剂量依赖关系。t检验表明，超临界co2萃取法提取的薰衣草精油清除·oh能力较强，与水蒸气蒸馏法提取的精油之间的抗氧化能力差异显著（p＜0.01）。
3.4 超氧阴离子清除能力测定在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成o -2·和有色中间产物，该有色物质在325 nm处有一特征吸收峰。当加入清除剂时，o -2·的生成受到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在325 nm处的吸光度减小。故通过测定a325值可以定量计算出清除剂的清除率。实验结果(见图3)表明,两种方法提取的薰衣草精油对超氧阴离子的生成均有抑制作用,且作用随着剂量的增加而增强。超临界co2萃取法提取的薰衣草精油作用较强，ec50为60.5 mg/l；水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油作用较弱，ec50为72.5 mg/l，差异具有统计学意义（p＜0.01）。
3.5 卵黄脂质过氧化抑制能力测定卵黄中磷脂c-2位上所含极低密度脂蛋白（vldl）和低密度脂蛋白（ldl）中的不饱和脂肪酸（pufa）在亚铁离子的催化下，能诱发过氧化，产生烷氧基（ro·）和烷过氧基（roo·）,从而引发链式反应。且在加热的条件下，其产生的过氧化物可与硫代巴比妥酸（tba）反应产生红色化合物，并在532 nm处有最大吸收。由图4可知，两种方法提取的薰衣草精油在实验浓度范围内对卵黄脂质过氧化的抑制作用呈良好的量效关系。超临界co2萃取法提取的薰衣草精油抑制卵黄脂质过氧化的作用明显强于水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油（p＜0.01）。
3.6 红细胞溶血实验该实验通过将大鼠红细胞暴露在氢过氧化枯烯中，测定红细胞膜对自由基诱导的溶血的耐受力，从而评价薰衣草精油的抗氧化活性。由图5可知，两种方法提取的薰衣草精油都对红细胞溶血有抑制作用，在实验浓度范围内，精油浓度越大，抑制作用越强，超临界co2萃取法提取的薰衣草精油抗红细胞溶血作用强于水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油（p＜0.05）。
4 讨论
机体在正常的生命过程中伴有自由基的产生，主要有超氧阴离子自由基、羟自由基、单线态氧、过氧化氢及过氧化脂质等。研究发现多种疾病都与自由基对机体的氧化损伤有关［8］，因此寻找能够清除自由基或抑制氧化作用的抗氧化剂备受人们关注。
薰衣草精油是指用从薰衣草正在开放的花序中提取再经整理制得的精油［9］。通常薰衣草花的品种、生长年限、采收时间、提取方法等对薰衣草精油的产量有较大影响。薰衣草挥发油主要化学成分为芳樟醇(37.60%)，乙酸芳樟酯(35.79%)，4-松油醇(4.51%)，乙酸薰衣草酯(4.11%)等，化合物类型以乙酸酯、醇、烯烃化合物为主。研究表明，薰衣草精油具有抗惊厥、镇静、利胆、驱风、驱虫等药理作用［10］。
实验结果表明超临界co2萃取法提取的薰衣草精油在5个氧化体系中抗氧化作用都比水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油要强，差异有统计学意义。这可能与两种方法提取的薰衣草精油所含抗氧化活性成分及其含量不同有关。研究表明，薰衣草醇和乙酸芳樟酯在超临界co2萃取法提取的薰衣草精油中的含量远高于在水蒸气蒸馏法提取的薰衣草精油中的含量［11］。此外，3，7-二甲基-1，5-辛二烯-3，7-二醇和5-乙烯基二氢-5-甲基-2（3h）-呋喃酮、喇叭茶醇、香豆素等组分是超临界co2萃取法提取的薰衣草精油所特有的，超临界co2萃取法提取的薰衣草精油抗氧化作用较强可能与此有关［12］。
水蒸气蒸馏法是目前应用最广泛的一种提取方法。设备简单、操作容易、成本低。但由于操作温度较高，会引起精油中热敏性化合物的热分解和易水解成分的水解。此外，提取出来的精油与空气接触，部分被氧化，致使其抗氧化能力降低。
超临界co2萃取技术是用处于超临界状态的co2流体经过超临界状态或液态向气态的相转变，将其携带的精油释放出来。首先，用超临界co2萃取法提取薰衣草精油，在最佳工艺条件下，能将要提取的成分几乎完全提取，提高了精油的得率。其次，超临界co2临界温度低，操作温度低，能较完好地保证薰衣草花中有效成分不被破坏，不发生次生化，特别适用于对热敏感性强、容易氧化分解破坏的成分的提取。再次，超临界co2还具有抗氧化作用，有利于保证和提高精油质量。超临界co2萃取技术的这些优点能较好地保持薰衣草中的有效成分不被氧化，从而提高其抗氧化活性。
上述结果表明，薰衣草精油具有良好的开发和应用价值，超临界co2萃取薰衣草精油技术值得开展产业化研究。但薰衣草精油有效成分与抗氧化活性之间的关系，以及在抗氧化体系中的分子机制等还有待进一步的研究。
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