作者：邢朝斌，王明艳，吴鹏，劳凤云
【摘要】 目的探讨2,4-d和培养基对刺五加愈伤组织和体细胞胚胎生产刺五加苷b、e的影响，建立有利于刺五加苷b、e积累的刺五加体外培养体系。方法将来自同一外植体的刺五加愈伤组织和体细胞胚胎分别诱导增殖或产生次级体胚，hplc法测定培养物中刺五加苷b、e含量和培养物质量，考察培养物类型、培养基种类和激素对刺五加苷b、e生产的影响。结果体细胞胚胎的质量虽略低于愈伤组织的质量，但体细胞胚胎生产刺五加苷b、e的能力优于愈伤组织。2,4-d对刺五加苷b、e含量影响较小，仅改变了培养物的质量。ms培养基处理中培养物的刺五加苷b、e产量优于1/2ms培养基。结论刺五加体外培养物可以生产刺五加苷b、e，其产量取决于培养物类型、培养基种类和2,4-d浓度。
【关键词】 刺五加； 刺五加苷b； 刺五加苷e； 愈伤组织； 体细胞胚胎
abstract:objectiveto discuss the effect of 2,4-d and culture medium to the callus and somatic embryos for the production of eleutherosides b, e, establish in vitro raise system of eleutherococcus senticosus harms.methodsusing callus and somatic embryos which came from the same explant to induce multiplication or to produce secondary somatic embryos. determined the content of eleutherosides b ,e and the weight of culture medium by hplc. the effect of eleutherosides b ,e by the cultures type, the culture medium kind and the hormone were studied.resultseven though the weight of somatic embryos was slightly lower than that of the callus,the ability of somatic embryos to produce eleutherosides b, e was better than the callus. 2,4-d had little effect on eleutherosides b, e, and only changed the weight of cultures. the production of eleutherosides b, e came from the cultures which was dealt with ms medium was higher than that in 1/2 ms medium. conclusionin vitro cultures of eleutherococcus senticosus harms can produce eleutherosides b, e, whose production is decided by the cultures type, the culture medium kind and the concentration of 2,4-d.
key words:eleutherococcus senticosus harms; eleutheroside b; eleutheroside e; callus; somatic embryos
刺五加eleutherococcus senticosus harms是我国医药珍品，根、茎、叶均可入药［1］。wWW.11665.cOm历代本草医药记载，其有益气健脾、补肾安神之功效，已载入《中国药典》（1977年版）。自20世纪70年代末以来以刺五加为原料生产的各种片剂、冲剂、针剂和刺五加参茶等产品远销国外，因而使刺五加资源消耗与日俱增［1,2］。经过几十年掠夺式的采挖，严重地破坏了野生刺五加资源；在自然状态下刺五加结实的株丛少，种子产量低、质量差、传播力弱、休眠程度深［2］，并且扦插成活率低、插穗来源少、管理程序繁琐［3］，1992年出版的《中国植物红皮书》已把刺五加列为了渐危物种。
植物组织、细胞培养具有快速、高效、低成本的优点，因而近年来利用植物组织、细胞培养快速繁殖刺五加的研究成为热点。目前多数研究集中于刺五加体细胞胚胎发生［4］和人工种子包埋［5］方面，并取得了可喜成果，对茎尖的快速繁殖、遗传转化也有初步探索［4］。但关于刺五加的体外培养物生产刺五加主要药用成分——刺五加苷b、e的研究尚未见报道。本文以刺五加的体外培养物为试材，探讨了培养物类型、培养基种类、激素对刺五加苷b、e生产的影响。
1 材料与方法
1.1 愈伤组织和体细胞胚胎的获得刺五加野生植株和种子采自吉林省伊通满族自治县西苇镇。种子经层积处理后，将种子的胚剖出，切取胚轴和野生植株萌发15 d以内的幼叶、叶柄作为外植体，接种在包含2,4-d 1.0 mg/l+naa 1.0或2.0 mg/l ms培养基上，分别诱导产生愈伤组织或体细胞胚胎［4,6］。
1.2 愈伤组织和体细胞胚胎质量的测定
将上述产自同一外植体的愈伤组织和体细胞胚胎分别继代入添加了0～1.0 mg/l 2,4-d的ms和1/2ms培养基中诱导愈伤组织增殖、体细胞胚胎产生次级体胚。培养60，120，180，240 d时分别取出增殖产生的全部愈伤组织和体细胞胚胎。用重蒸水洗净粘附的培养基后，置于滤纸上吸干表面水珠，称取质量。
1.3 刺五加苷b、e含量的测定
hp-1100高效液相色谱仪为安捷伦科技有限公司生产，乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂为分析纯。对照品购自中国药品生物制品检定所,刺五加苷b编号为111574-200201，刺五加苷e编号为111713-200501。色谱条件：色谱柱：kromasil ods柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相：0.1％ 磷酸水溶液-乙腈(0→25 min，90∶10→80∶20)，流速为0.8 ml·min-1；柱温：室温。刺五加苷 b、苷 e 的检测波长分别是220 nm及206 nm。
取刺五加的体外培养物置于干燥箱中70℃烘干后，粉碎。精密称取0.5 g，置于100 ml圆底烧瓶中。参照文献［7］的方法，加入50％甲醇溶液20 ml，回流提取1 h，抽滤，滤液用50％ 甲醇溶解定容至25 ml。取滤液适量，12 000 r·min-1离心5 min，上清液作为供试品溶液。测定其刺五加苷b、e的峰面积，根据刺五加苷 b 的回归方程y= 64.584x+2.8729,刺五加苷e回归方程y=89.603x+23.808，计算刺五加苷b、e含量。
1.4 刺五加苷b、e产量的计算公式为：刺五加苷b、e产量(mg)=刺五加苷b、e含量（mg/100g）×培养物质量(g)/100。
2 结果
2.1 体外培养物类型对刺五加苷b、e产量的影响以相同质量的外植体材料为起始材料，分别按照最佳体细胞胚胎和愈伤组织培养体系经240 d培养后诱导产生的愈伤组织和体细胞胚胎的刺五加苷b、e产量如表1所示。
在整个培养过程中，愈伤组织和体细胞胚胎的物质质量随着培养时间的延长呈现指数增长。在测定的4个时间点上，诱导产生的愈伤组织的质量均大于体细胞胚胎的质量。刺五加苷b、e的含量在愈伤组织培养120 d以内逐渐上升，培养时间超过120 d后含量维持在稳定状态；体细胞胚胎自产生开始到培养240 d范围内的刺五加苷b、e含量均差异不大。综合考虑刺五加苷b、e含量和物质质量两个因素的变化，体细胞胚胎虽然在总物质质量上均低于愈伤组织，但由于刺五加苷b、e含量较高，因此在相同培养时间内，同质量外植体产生的体细胞胚胎的刺五加苷b、e的产量优于愈伤组织。表1 体外培养物类型对刺五加苷b、e产量的影响（略）
2.2 激素对刺五加苷b、e产量的影响2,4-d对体细胞胚胎生产刺五加苷的影响如表2所示。刺五加苷b、e产量较高的体细胞胚胎在2,4-d 0～1.0 mg/l范围内培养60 d内，刺五加苷b、e含量差异不显著，因此刺五加苷b、e的产量主要受激素对体细胞胚胎质量的影响。2,4-d浓度为0或0.1 mg/l时体外先期产生的体细胞胚胎逐渐产生大量次级体细胞胚胎，而0.5，1.0 mg/l的情况下次级体胚产生量极少，同时早期产生的体胚出现畸形现象。在1.0 mg/l的2,4-d的处理中，原有体细胞胚胎与培养基接触处逐渐产生愈伤组织，该愈伤组织整体继代入不含2,4-d的ms培养基后可产生新的体细胞胚胎，但其产生量较少。表2 2,4-d对刺五加体细胞胚胎中刺五加苷b、e含量的影响（略）
2.3 培养基对刺五加苷b、e产量的影响ms培养基和1/2ms培养基处理培养60 d后，对刺五加苷b、e产量的影响如表3所示。
ms培养基处理中体细胞胚胎的刺五加苷b含量显著高于1/2ms培养基处理的含量，刺五加苷e含量在两者之间差异不大。ms培养基中培养物质量略高于1/2ms培养基。在相同条件下培养60 d后ms培养基的刺五加苷b、e产量略优于1/2ms培养基的处理。表3 培养基类型对刺五加苷b、e产量的影响（略）
3 讨论
利用组织培养生产药用植物次生代谢产物过程中，一般来讲，利用疏松易碎，生长速度快，利于悬浮培养的愈伤组织作为体外培养物较为多见，如红豆杉、茜草等［8］。刺五加在体外培养过程中较容易形成愈伤组织，接种后2周，即从切口处即可见淡黄色、颗粒状的愈伤组织产生，4周后整个外植体完全被愈伤组织所覆盖。将之每隔4周继代入相同培养基，可使其长期保持生命力［9］。但与其他植物不同的是，刺五加具备较好的愈伤组织发生能力的同时也具有良好的体细胞胚胎发生能力，且其体细胞胚胎自产生的同时其上即可产生大量的次级体细胞胚胎，次级体胚能继续产生三级、四级体胚［4］，加之体细胞胚胎中刺五加苷b、e含量较之愈伤组织更高，因此利用体细胞胚胎生产刺五加苷b、e更为便利。
在多数植物中，2,4-d只对胚性细胞或细胞团的形成起到诱导作用，而对体细胞胚胎的进一步发育与生长却是抑制的因素。但对于刺五加而言，不管其体胚发生途径如何，2,4-d对胚性细胞的诱导及体胚的分化均起到了促进作用［4］，而不同浓度处理中的刺五加苷b、e含量和质量间差异不大，因此对于利用体细胞胚胎生产刺五加苷b、e而言，从成本的角度出发，未添加激素的培养基较为适宜。
ms培养基较之1/2ms培养基，大量元素增加1倍，其它成分相同。即在其它条件相当的情况下ms培养基中n源为1/2ms培养基的2倍。与天山雪莲组织培养中，提高培养基中nh4no3浓度，有利于愈伤组织生长和总黄酮的形成相似［10］，ms培养基中刺五加的体细胞胚胎质量和刺五加苷b、e含量均略优于1/2ms培养基的处理。
【参考文献】
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