作者：吴勇，李政木，卓廉佳，陈炜璇，范明威
【摘要】 目的用肾气丸各拆方组水煎液灌胃肾阳虚大鼠，测定灌胃后各组大鼠下丘脑中多巴胺（da）、五羟色胺（5-ht）的含量，分析肾气丸“阴中求阳”治疗肾阳虚证的机理。方法以氢化可的松25 mg/(kg·d）注射大鼠，连续12 d，同时以各肾气丸拆方组水煎液灌胃，于灌胃第21天，麻醉大鼠，取出下丘脑，称重，以5%高氯酸匀浆，高速低温离心后分取上清液，用高效液相色谱法检测da，5-ht的含量。结果与正常组比较，模型组大鼠下丘脑中da、5-ht含量升高，经灌胃给药后，各拆方组大鼠下丘脑中da，5-ht的含量均有不同程度的降低，以阴阳双补组含量最低，而补阳组降低不明显，其中阴阳双补1组含量低于补阳1组，阴阳双补2组含量低于补阳2组,具有统计学意义。结论降低下丘脑中多巴胺、五羟色胺的含量，可能是肾气丸“阴中求阳”配伍治疗肾阳虚证的机理之一。
【关键词】 肾气丸 阴中求阳 肾阳虚证 多巴胺 五羟色胺 高效液相色谱法
abstract：objectiveto study the influence of compatibility of shenqi pill "reinforcing yang from yin" on the contents of da,5-ht in hypothalamus of deficient kidney-yang rats.methodsthe rats were injected with cortisone at the dose of 25 mg/(kg·d) for consecutive 12 days and adminstered with dismantled decoction at the same time. on the 21st day, the rats were sacrificed and the contents of da ,5-ht in hypothalamus were measured by the method of high performance liquid chromatogram. resultscompared with normal group, the contents of da,5-ht was increased in model group. after intragastric administration, the content of da,5-ht in each dismantled group were decreased at different level in hypothalamus. the first group of invigorating yin-yang was higher than the first group of invigorating yang, the second group of invigorating yin-yang was higher than the second group of invigorating yang, and all of these had statistic significance. conclusionthe decrease of da,5-ht contents in hypothalamus is likely to be the mechanism by which shenqi pill treats the kidney-yang asthenia syndrome by the compatibility of "reinforcing yang from yin".
key words：shenqi pill; reinforcing yang from yin; kidney-yang asthenia syndrome; da； 5-ht; hplc
肾气丸是临床治疗肾阳虚证的名方，方由大量滋阴补肾的药物配伍少量的桂枝、附子而成，以“阴中求阳”微微生火以治疗肾阳虚证。WwW.11665.COM为分析肾气丸此种“阴中求阳”配伍治疗肾阳虚证的药效机理，本研究以氢化可的松制作大鼠肾阳虚模型，观察肾气丸及其各拆方组水煎液灌胃大鼠后，比较各组大鼠下丘脑神经递质多巴胺（da）、五羟色胺（5-ht）的含量变化。现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 动物健康spf级雄性sd大鼠88只，体质量200g左右，广东省实验动物中心提供［质量合格证编号:0026197,许可证号：scxk（粤）2003-0002 粤监证字2007a003］。正常光照，自由饮水、摄食，适应性喂养5 d后，随机分为正常组（a组）、模型组（b组）、补阳1组（c组）、补阳2组（d组）、补阴1组（e组）、补阴2组（f组）、阴阳双补1组（g组）、阴阳双补2组（h组），共8组，每组11只。
1.2 仪器日立cr22g低温高速离心机；dionex summit高效液相色谱仪（美国dionex公司），chromeleon色谱工作站（美国dionex公司），hp1049a电化学检测器（美国安捷伦公司），玻璃碳工作电极和ag/agcl参比电极，phs-2c精密酸度计（上海理达仪器厂），分析天平 (万分之一，北京赛多利斯天平有限公司)。
1.3 试剂氢化可的松（天津金耀氨基酸有限公司 批号：0612011），乌拉坦（国药集团化学试剂有限公司 批号120060323），多巴胺（da）、5-羟色胺（5-ht）均购自sigma公司，乙腈购自美国tedia公司，其余试剂均为市售分析纯。
1.4 药物分组肾气丸组方药材（经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品），补阳1组（c组）：附子、桂枝；补阳2组（d组）：附子、桂枝＋茯苓、泽泻、丹皮；补阴1组（e组）：干地黄、山茱萸、山药；补阴2组（f组）：干地黄、山茱萸、山药＋茯苓、泽泻、丹皮；阴阳双补1组（g组）：附子、桂枝＋干地黄、山茱萸、山药；阴阳双补2组（h组）：即肾气丸组： 附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、丹皮；其中药物附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、丹皮组成比例为1∶1∶8∶4∶4∶3∶3∶3（按原方比例）。
2 方法和结果
2.1 给药与取材除正常组大鼠外，其余大鼠均每天大腿内侧肌肉注射氢化可的松25 mg/kg，连续12 d，同时开始灌胃（药量按体表面积法［1］折算为成人用量的5倍，灌胃体积1 ml/100g）给药，正常组、模型组给予等体积生理盐水，连续给药20 d。于给药第21天上午8时，以乌拉坦（剂量1g/kg）麻醉大鼠，迅速取出大鼠全脑，分离出下丘脑，称重，以5%高氯酸匀浆，低温高速离心（-4℃ 15 000 r/min）30 min，分取上清液，存于-80℃冰箱待测。
2.2 色谱条件色谱柱为develosil c30-ug-5（150 mm×4.6 mm, 5 μm，日本nomura chemical co., ltd）；流动相为磷酸二氢钾溶液（25 mmol/l，内含乙二胺四乙酸二钠0.5 mmol/l，用磷酸调ph 3.4）∶ 乙腈 = 95∶5（体积比），用前经0.45 μm滤膜真空抽滤，流速0.5 ml/min；玻璃碳工作电极，ag/agcl参比电极，检测电位0.6 v；柱温25 ℃，自动进样器温度5 ℃。进样量50 μl。
2.3 实验结果含量计算公式［2］：含量(μg／g湿组织)=cv／w，式中c为大鼠下丘脑样品测定浓度(μg／m1)，v为样品预处理过程中加入液体体积总量(m1)，w为下丘脑湿重(g)。实验数据采用±s表示，统计采用spss统计软件分析。结果见表1～2。表1 拆方肾气丸灌胃各组大鼠后下丘脑中da的含量，表2 拆方肾气丸灌胃各组大鼠后下丘脑中5-ht的含量（略）
3 讨论
现代对肾阳虚证的研究发现［3］，肾阳虚患者普遍有尿17 羟皮质类固醇含量值低下的现象，肾阳虚证具有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴不同环节(层次) 、不同程度的功能紊乱，而通过对神经内分泌免疫网络的大量实验证实：肾阳虚证与神经内分泌免疫网络有内在联系，补肾药是调节下丘脑、神经内分泌免疫网络、下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的有效手段, 肾阳虚证涵盖着神经内分泌免疫网络。另有研究证实［4］用外源性皮质酮造成大鼠下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺（hpat）轴模型以模拟“肾阳虚”证，从模型组看，由外源性皮质酮反馈抑制hpat轴的同时，激活下丘脑等单胺类神经递质，如去甲肾上腺素（ne）、多巴胺（da）、五羟色胺（5-ht）、五羟吲哚乙酸（5hiaa）等含量增高，同时温补肾阳药能明显改善上述指标，能明显改善hpat轴的功能。
多巴胺与五羟色胺均为抑制性神经递质，有研究显示［5］外源性糖皮质激素在抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴（hpa）时，可能激活中枢单胺类递质（da、5-ht）的合成与代谢，温补肾阳的右归饮在改善大鼠hpa轴抑制程度的同时，抑制其中单胺类递质的激活。本实验中大鼠在注射了外源性的糖皮质激素轻化可的松后，模型组大鼠下丘脑中多巴胺、5-羟色胺含量增高，经肾气丸各拆方组灌胃后，二者的含量均有不同程度降低，以阴阳双补组降低趋势显著。
本实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠下丘脑中多巴胺（da）、五羟色胺（5-ht）含量升高，经灌胃给药后，各拆方组大鼠下丘脑中da、5-ht的含量均有不同程度的降低，以阴阳双补组含量最低，而补阳组降低不明显，其中阴阳双补1组含量低于补阳1组，阴阳双补2组含量低于补阳2组，具有统计学意义。即以“阴中求阳”的肾气丸全方组大鼠下丘脑中da、5-ht的含量降低最为显著，并明显低于纯补阳组。
中医认为阴阳互根互用，而“孤阴不生，独阳不长”，著名医家张景岳提出“善补阳者必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷”。肾阳虚证若单用大量温补肾阳的药物反致虚不受补且有助热之弊，而通过在大量的滋阴补肾药中加入少量的温阳药，使温阳药化气有源，以阴中求阳来治疗肾阳虚证。肾气丸是临床上治疗肾阳虚证的名方，方以大量的滋阴补肾的药物配伍少量温阳的桂枝、附子而成，以达“阴中求阳”之意，微微生火以生肾气来治疗肾阳虚证。
综上所述，温补肾阳药在降低多巴胺、无羟色胺含量的同时，改善下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，从而改善肾阳虚证症状。结合实验结果，模型组大鼠下丘脑中多巴胺（da）、五羟色胺（5-ht）含量较正常组高，经灌胃给药后，各拆方组大鼠下丘脑中da、5-ht的含量均有不同程度的降低，且以阴阳双补组的含量低于纯补阳组，说明大鼠下丘脑中da、5-ht含量的降低与肾气丸“阴中求阳”的配伍相关，故降低下丘脑中多巴胺、五羟色胺的含量，可能是肾气丸“阴中求阳”配伍治疗肾阳虚证的机理之一。
【参考文献】
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