作者：林於，马廉举，刘新，卓玉娟，张桂萍，姜展，郭虎，袁配
【摘要】 目的 制定巴山冷杉中莽草酸的提取工艺，并建立其含量测定方法。方法 采用水提-醇沉法对莽草酸进行提取,采用hplc法测定莽草酸的含量。结果 莽草酸在5～300 μg·ml-1范围内，质量浓度与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 3)，平均回收率为94.5%，rsd=2.5%(n=5)。莽草酸收率为0.51%(纯度≥96%)。结论 本提取工艺简便易行;含量测定方法简便、准确、重复性好，可用于巴山冷杉中莽草酸的含量测定。
【关键词】 巴山冷杉;莽草酸;提取工艺;含量测定
(shool of chinese indigenous medicine,chongqing medical university,chongqing 400016,china)abstract:objective to establish methods for the determination and extraction of shikimic acid from abies fargesii franch.methods shikimic acid was extracted with h2o,and hplc was employed to determine shikimic acid.results the linearity of shikimic acid was good in the range of 5-300 μg·ml-1(r=0.999 3),and the average recovery was 94.5%(rsd=2.5%,n=5). the yield of shikimic acid was 0.51%(purity≥96%).conclusion the extraction technology is simple and convenient.this method is convenient,rapid and accurate,and can be used for the determination of shikimic acid in abies fargesii franch.
key words:abies fargesii franch; shikimic acid; extraction process;determination
目前莽草酸主要来源于木兰科八角茴香(fructus anisi stellati)，为抗禽流感与甲流感药物磷酸奥司他韦(oseltamivir phosphate)的重要前体[1]，故研究莽草酸的新资源具有重要的意义。wWw.11665.com据报道松科杉属植物(圣诞树类)中含有莽草酸(shikimic acid)，并具有 工业 生产价值[2]。同属植物巴山冷杉(abies fargesii franch)是我国独有物种，分布在海拔1500～3000 m的以秦巴山地为中心的大巴山、秦岭与神农架等地山区[3]。巴山冷杉中是否含有莽草酸及其提取分离、含量测定方法等研究尚未见报道。
1 材料与仪器
lc/ms 2010a液质联用仪(岛津，电喷雾离子化接口单级四极杆质谱检测器，esi离子源);agilent1100高效液相色谱仪(美国)，vdw紫外检测器(美国);分析天平(mettler toledo ag135);uv2501pc(岛津);pe红外分光光度仪(美国);lxj11b离心机(上海精密仪器仪表有限公司)。
巴山冷杉，采自巫山县小山峡，经重庆医科大学生药室王刚副教授鉴定为松科植物巴山冷杉(abies fargesii franch)。取其嫩茎及叶于90 ℃干燥，粗碎，备用;莽草酸对照品(批号：20060102，西安飞达生物技术有限公司，质量分数98%);水为重蒸水或去离子水;甲醇为色谱纯，其余试剂分析纯。
2 方法与结果
2.1 巴山冷杉叶中莽草酸的鉴定
参考 文献 [4]从松科马尾松中获得莽草酸的方法，取冷杉叶粗粉2 kg，8倍量水煎煮2次，滤过，合并滤液，减压浓缩至样品∶溶液≈1∶1，静置24 h，离心(5 000 r·min-1)，取上清液，用乙酸乙酯1 500 ml分次萃取，水相用水饱和的正丁醇1 500 ml分次萃取，合并正丁醇部分，减压浓缩使成稠膏，加适量甲醇微热使溶，进行柱层析(硅胶)，薄层色谱追踪检测，以石油醚乙酸乙酯(体积比4∶1)洗脱，再用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，回收甲醇，用甲醇丙酮(体积比4∶1)反复重结晶，得白色晶体0.8 g，作为样品。mp 187～188 ℃。ir (kbr)cm-1： 3 482，
2 953～2 523， 1 682， 1 648， 1 455， 1 292， 1 277，
1 092，1 072，931，863，739，样品的波谱、质谱数据均与莽草酸对照品相一致，见图1～3。广东药学院学报 第26卷 第4期 林於，等.巴山冷杉中莽草酸的提取工艺及含量测定初步研究
2.2 巴山冷杉叶中莽草酸的提取、分离工艺研究
2.2.1 提取次数的考察 取巴山冷杉叶粗粉(莽草酸含量为0.91%)500 g，加适量水煎煮3次，每次60 min，分取各次提取液，分别离心(5 000 r·min-1)，滤过。分取各次提取液适量，依“2.3.1”项下方法测定并 计算 莽草酸含量，参照药典附录ⅸ h烘干法测定干浸膏量，结果见表1。表1表明，第2次提取莽草酸的转移率为14.1%，仅为第1次提取莽草酸的转移率的17%;而第2次提取的杂质量却为第1次提取的41%。因巴山冷杉叶成本低，而提取、浓缩过程中所耗能源、时间较多，故选择的提取工艺为：10倍量水煎煮提取1次，提取时间60 min。
2.2.2 分离纯化工艺 经反复考察，最后确定的分离纯化工艺如图4。按此工艺纯化所得莽草酸结晶的纯度为96.2%，收率为0.51%(结晶量/投料量)。
提取液浓缩静置24 h上清液乙醚乙酸乙酯(体积比1∶1)萃取脱脂水溶液浓缩
稠膏加乙醇至含醇60%静置24 h上清液回收乙醇减压抽干干浸膏甲醇溶解活性炭回流脱色，滤过
滤液回收甲醇减压抽干莽草酸粗品丙酮回流溶解放置析晶莽草酸粗晶甲醇丙酮(体积比4∶1)重结晶莽草酸结晶
2.3 莽草酸的含量测定
2.3.1 色谱条件[5] 色谱柱：diamonsil c18(250 mm×416 mm，5 μm)柱;流动相：5 mmol·l-1h3po4溶液(用2 mol·l-1naoh调ph至6.2，再加入四丁基溴化铵，使其浓度为1 mmol·l-1)甲醇(体积比90∶10);检测波长：217 nm;流速：1.0 ml·min-1;柱温：25 ℃;进样量：20 μl。在上述条件下，莽草酸与杂质完全分离，对称性好，理论塔板数以莽草酸峰计不低于5 000，见图5。
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取莽草酸对照品适量，用流动相稀释，配制成质量浓度为0.1 mg·ml-1的对照品溶液。
2.3.3 供试品溶液的制备 取冷杉叶粗粉约2.0 g，精确称定，置200 ml量瓶中，加重蒸水至刻度，浸泡12 h，超声处理30 min，放置至室温后补充重蒸水至刻度，摇匀。取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。表1 不同提取次数的考察结果 注： 杂质量=干浸膏量-莽草酸量，莽草酸转移率=莽草酸提取量/莽草酸理论量×100%
2.3.4 线性关系考察 精密称取莽草酸对照品25 mg，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，精密量取上述对照品溶液0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、6.0 ml，分别置10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，按“2.3.1”项下色谱条件进样20 μl，测定峰面积。以对照品峰面积(a)对莽草酸质量浓度(ρ)做线性分析，得线性回归方程为：a=35.394ρ+33.071，r=0.999 3。莽草酸在5～300 μg·ml-1 范围内与其峰面积积分值线性关系良好。
2.3.5 精密度试验 精密吸取莽草酸对照品溶液20 μl，按“2.3.1”项下色谱条件，连续测定5次，分别测定峰面积积分值，其rsd为0.42%，表明仪器精密度良好。
2.3.6 稳定性试验 取供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件，于0、4、8、12 h分别测定莽草酸峰面积， 计算 峰面积的rsd为0.82%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。
2.3.7 重复性试验 精密称取同一批冷杉叶粗粉5份，每份约2.0 g，按“2.3.3”项下方法进行制备，精密吸取供试品溶液20 μl，依法测定，莽草酸峰面积积分值的rsd为0.93% (n=5)，表明方法重复性良好。
2.3.8 加样回收率试验 精密称取同一批巴山冷杉叶粗粉6份，每份约2.0 g，分别加入莽草酸对照品适量，按“2.3.3”项下方法制备，依法测定，计算回收率，结果见表2。
2.3.9 样品测定 取同一批巴山冷杉叶干燥粗粉约2.0 g，按“2.3.3”项下方法制备样品溶液，依法测定。3次测定莽草酸质量分数分别为0.93%、0.91%、0.89%，平均为0.91%。表2 加样回收率试验结果
3 讨论
3.1 本研究从巴山冷杉中首次分离得到莽草酸。松科杉属植物中莽草酸提取工艺尚未见报道，预实验显示，用松科松属植物马尾松中莽草酸的正丁醇萃取硅胶柱分离法[4]，硅胶再生困难，将导致规模化生产成本高。而木兰科八角茴香果实中莽草酸提取所采用的有机溶剂浸提法和萃取法[6-8]，也不适用于冷杉叶的提取。冷杉叶中叶绿素与松脂类成分可溶于有机溶媒，而莽草酸易溶于水，故选水为提取溶剂。冷杉叶中水溶性大分子与水溶性色素在高温煎煮下溶出，水溶性大分子采用体积分数60%乙醇沉淀，水溶性色素用活性炭脱色，方法简便，但对收率影响较大，如何提高产品收率，有待进一步研究。
3.2 巴山冷杉与马尾松为同科植物，生长环境、植物形态等相近，故测定马尾松中莽草酸含量的hplc方法[3]也适用于巴山冷杉。
3.3 巴山冷杉资源的蕴藏量较大，但其中莽草酸含量不高。且冷杉叶中莽草酸含量随季节波动，老、嫩叶中含量波动也较大，使工艺参数无法稳定。故若要开发巴山冷杉作为莽草酸的来源植物，需详细考察其含量波动 规律 ，解决原料不太稳定的问题，同时改进提取分离工艺，使其收率提高，适用于 工业 化大生产。
【 参考 文献 】
[1] 达菲、莽草酸、八角分析报告[eb/ol].http://finance.sina.com.cn/stock/hyyj/20090520/15256251443.shtml.
[2] 圣诞树可用来提取抗禽流感药物[eb/ol].http://scitech.people.com.cn/gb/4039674.html.
[3] 蒋雪琴,刘艳红,赵本元.湖北神农架地区巴山冷杉(abies fargesii)种群结构特征与空间分布格局[j].生态学报,2009,29(5):2211-2218.
[4] 毕跃峰,郑晓珂,刘宏民,等.马尾松松针化学成分的研究[j].药学学报,2001,36(11):832-835.
[5] 马廉举,刘新.反相离子对色谱法测定马尾松松针中莽草酸的含量[j].中药材,2008,31(1):63-65.
[6] 廖洪利,臧志和.八角茴香中莽草酸的提取[j].成都医学院学报,2006,1(2):130-131.
[7] 钟昌勇.八角有效成分莽草酸提取新工艺[j].福建林业科技,2008,35(1):214-215.
[8] 刘永友,廖晓峰.八角茴香中莽草酸的提取工艺研究[j].食品研究与开发,2008,29(5):88-93.
