作者：冯玉静，王定勇，陈铭祥
【摘要】 目的 对南蛇藤中扁蒴藤素提取纯化工艺进行研究。方法 南蛇藤根粉经丙酮冷浸提取后，采用聚酰胺柱层析及硅胶柱层析进行分离纯化；以hplc法测定产品中扁蒴藤素的含量，并以其为指标对分离纯化的主要工艺参数进行优化。结果 将待分离的南蛇藤丙酮浸膏和聚酰胺(60～100目)按物料比0.02（质量比）装入层析柱中，常压下用体积分数75%的甲醇洗脱至洗脱液近无色，收集流分，浓缩后得到粗品，经硅胶柱层析进一步纯化，再经重结晶后纯度提高到98.0%以上。结论 该工艺简单、成本较低，适于工业化。
【关键词】 南蛇藤 扁蒴藤素 聚酰胺柱层析 硅胶柱层析 分离 纯化
abstract:objective to study the isolation and purification condition of pristimerin from celastrus orbiculatus thunb. methods pristimerin was isolated and purified by polyamide column chromatography and silica gel column chromatography, and the content of pristimerin was determined by hplc. the main isolation factors were optimized. results the optimum isolation conditions were as following: the weight ratio of sample to polymide was 0.02, 75% methanol was used for eluent. under the conditions above, crude product was obtained, which was further purified by silica gel column chromatography and recrystallized. finally, the purity reached to 98%. conclusion this method is simple and economic, which could be used in industry.
key words:celastrus orbiculatus thunb；pristimerin；polyamide column chromatography；silica gel column chromatography
南蛇藤celastrus orbiculatus thunb.系卫矛科南蛇藤属植物，又名过山风、苦树皮等。wWw.11665.COM全草均可入药，有清热、祛风、除湿、活血、解毒等功效，常用于治疗风湿性关节炎、腰腿痛等症［1］。目前已从南蛇藤植物中分离得到60余种化合物，主要为β二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯、生物碱、三萜类，此外还有黄酮类、有机酸类、多元醇类、甾体类及鞣质［2］。1996年,蒋毅［3］等从南蛇藤根皮中提取出橙红色结晶扁蒴藤素。
扁蒴藤素是一种醌甲基三萜类化合物，具有广谱抗肿瘤［3,4］、抗炎［5］、抗氧化［6］等多种药理活性，主要存在于卫矛科和希藤科植物中。有研究发现，在给药初期的24 h内，非致瘤性的人类乳房上皮细胞菌株mcf10a对扁蒴藤素的抵制力是人乳腺癌细胞（mdamb231）的2倍，表明扁蒴藤素对肿瘤细胞具有很好的选择性，可开发成为高选择性的抗肿瘤化疗药［7］。2008年,yang等［8］发现扁蒴藤素为一种新的蛋白酶体抑制剂，使得扁蒴藤素成为抗肿瘤研究的热点。南蛇藤分布广泛，在我国东北、华北、华东、西北、西南及湖北、湖南、广东等均有分布，资源丰富，因此目前的研究常选择南蛇藤作为扁蒴藤素的来源植物。目前已有一项从粉背南蛇藤(celastrus hypoleucus)中提取扁蒴藤素的工艺专利［9］，本文选择南蛇藤作为来源植物，采用聚酰胺柱层析和硅胶柱层析结合的双柱层析的方法得到高纯度的扁蒴藤素。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
南蛇藤根皮采自广东阳春，扁蒴藤素对照品为实验室自制（经hplc测定，纯度≥98%），甲醇（色谱纯，迪马公司），甲醇、石油醚、乙酸乙酯（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司），水（自制超纯水/蒸馏水），聚酰胺（60～100目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂），硅胶（200～300目，青岛海洋化工厂分厂）。
1.2 仪器
re52cs旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂)；shzd(ⅲ)循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸科技有限公司；lc10atvp高效液相色谱仪（shimadzu）；spdm10avp紫外检测器（shimadzu）。
1.3 实验方法
将丙酮提取液过滤，浓缩，拌入聚酰胺，烘干，研磨，过筛，得粗品，经聚酰胺柱层析分离，以hplc法测定粗品中扁蒴藤素的含量，以产品得率和产品纯度（质量分数)为指标，分别考察洗脱剂、物料比等影响因素，优化出最佳的分离工艺参数。粗品再通过硅胶柱层析进一步纯化，得到较纯品。再选用不同的溶剂进行重结晶，从中选出最佳的溶剂进行精制，得到扁蒴藤素橙红色针状结晶。
1.4 扁蒴藤素的含量测定方法
1.4.1 对照品溶液的配制 精密称取扁蒴藤素对照品5.1 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀，制得质量浓度为204.0 μg/ml的对照品溶液。分别吸取1、2、3、4、5 ml的对照品溶液于10 ml的量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，得质量浓度依次为20.4、40.8、61.2、81.6、102.0 μg/ml的一系列对照品溶液。
1.4.2 测定波长的选择 取质量浓度为61.2 μg/ml的对照品溶液，以甲醇为空白对照，在200～600 nm的波长范围扫描，结果表明扁蒴藤素在424 nm有最大吸收，在258 nm有较大吸收；取少量南蛇藤丙酮浸膏，加甲醇溶解，用光电二极管阵列紫外检测器在200～600 nm的波长范围测定，结果表明丙酮浸膏在258 nm有较多的成分有紫外吸收，在424 nm只有很少的成分有紫外吸收，见图1、图2。为更好的反映分离纯化效果,选择258 nm为测定波长。
1.4.3 色谱条件 色谱柱：迪马公司diamonsiltm c18 (5 μm,250mm×4.6 mm)，流动相：甲醇0.1%磷酸(体积比88∶12)，检测波长：258 nm，柱温：室温，流速：1.0 ml/min，进样量：20 μl。
图1 扁蒴藤素的紫外吸收图谱（略）
figure 1 uv spectrum of pristimerin
图2 丙酮浸膏的三维hplc图谱（略）
figure 2 threedimensional hplc spectrum of acetone extract
1.4.4 线性关系考察 取上述系列浓度的对照品溶液按“1.4.3”项色谱条件测定,记录峰面积（a）,并对样品质量浓度（ρ）作图，得回归方程a=1.991×104+2.473×104ρ，r=0.999 8(n=5)。结果表明，扁蒴藤素质量浓度在20～102 μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2 实验结果
2.1 洗脱溶剂的选择
称取聚酰胺(60～100目)10.0 g 3份，装入3根柱长和内径完全相同的柱子，分别称取浸膏约0.1 g，加适量丙酮溶解后拌入适量聚酰胺，烘干，研磨，过筛，装入3根柱子顶端，然后依次用等体积的不同洗脱剂（甲醇水的体积比依次为3∶1、4∶1、5∶1）洗脱，收集各自的洗脱液，至洗脱液近无色，合并，浓缩，干燥得扁蒴藤素粗品。将扁蒴藤素粗品用甲醇溶解，按“1.4.3”项色谱条件以hplc法测定粗品中扁蒴藤素的含量，计算粗品中扁蒴藤素的纯度（质量分数）和收率，比较不同洗脱剂比例对扁蒴藤素的分离提纯效果。见表1。
表1 洗脱剂比例对产品纯度和收率的影响（略）
table 1 effects of solvent on product recovery and purity
由表1可见，洗脱剂比例为3∶1时产品的纯度最高，而不同的洗脱比例对产品收率的影响不大，所以选择甲醇水（体积比3∶1）作为洗脱溶剂。
2.2 上样量的考察
称取10.0 g 聚酰胺(60～100目)3份，装入3根柱长内径完全相同的柱子，分别称取0.1 g、0.2 g、0.5 g 浸膏，按“2.1”项下操作，使物料比(浸膏与聚酰胺质量比)分别为0.01、0.02、0.05，用甲醇水（体积比3∶1）洗脱，收集洗脱液，合并，浓缩，干燥得扁蒴藤素粗品。按“1.4.3”项下方法进样测定，计算粗品中扁蒴藤素的纯度（质量分数）和收率，比较不同物料比对扁蒴藤素的分离提纯效果。见表2。
表2 物料比对产品纯度和收率的影响（略）
table 2 effects of rate of crude pristimerin to polyamide on product recovery and purity
由表2可见，当物料比为0.02 时，所得扁蒴藤素的纯度最高，而不同的物料比对产品的收率无明显影响。因此，选择0.02为最佳物料比。
2.3 硅胶柱层析
使用200～300目硅胶，采用石油醚湿法装柱，将粗品用少量丙酮溶解，拌入硅胶，烘干，研磨，过筛，加入柱子顶端，先以石油醚乙酸乙酯（体积比20∶1）洗脱一段时间，前沿黄色色带被洗脱下来后，改以石油醚乙酸乙酯（体积比10∶1）洗脱，至红色色带被洗脱下来时开始收集洗脱液，点板，合并，浓缩，得到较纯品，按“1.4.3”项色谱条件以hplc测定其纯度为85.14%（峰面积归一化法）。
2.4 重结晶
将经过2次柱层析后的较纯品，在加热、搅拌的条件下加入石油醚乙酸乙酯（体积比10∶1）至完全溶解，趁热过滤，冰箱中放置析晶，得到橙红色针状结晶。
2.5 优化工艺
南蛇藤根丙酮浸膏经过聚酰胺柱层析纯化，按物料比0.02（浸膏与聚酰胺的质量比）装入层析柱中，常压下用甲醇水(体积比3∶1)洗脱，收集洗脱液至洗脱液近无色，浓缩后得到粗品，再经硅胶柱层析，得到纯度为85.0%的产品，此产品经过石油醚乙酸乙酯（体积比10∶1)重结晶，最终得到扁蒴藤素质量分数达98.0%以上的产品。
3 扁蒴藤素的纯度及结构鉴定
3.1 纯度测定
取适量扁蒴藤素晶体，加甲醇溶解，按“1.4.3”项色谱条件测定，利用峰面积归一化法计算得扁蒴藤素的纯度为98.85% 。
图3 扁蒴藤素产品的hplc图谱
figure 3 hplc spectrum of the product
3.2 结构鉴定
扁蒴藤素，橙红色针状结晶（石油醚乙酸乙酯），理化及光谱性质与文献［2,3］中报道一致，结构式如下：
图4 扁蒴藤素的结构式（略）
figure 4 structure of pristimerin
各种波谱数据归属如下：uv meoh λmax/nm：204，258，424。ir kbr νmax/cm-1：3 350，2 940， 1 725，1 650，1 590，1 520，1 435，1 375，1 300，1 245， 1 220，1 205，1 185，1 155，1 145，1 095，1 085，990，870，860，850。esims(+)：487(［m+na］+)，465(［m+h］+)，263，202，201。13cnmr (cdcl3) δ :119.5(c1)，178.2(c2)，146.0(c3)，117.2(c4)，127.4(c5)，134.2(c6)，118.1(c7)，170.3(c8)，43.0(c9)，164.8(c10)，33.5(c11)，29.6(c12)，39.4(c13)，45.0(c14)，28.6(c15)，36.4（c16)，30.5(c17)，44.3(c18)，30.9(c19)，40.4(c20)，29.9(c21)，34.8(c22)，10.2(c23)，38.2(c25)，21.6(c26)，18.3(c27)，31.6(c28)，178.7(c29)，32.7(c30)，51.5(c31)。1hnmr (cdcl3) δ :7.02(1h, d, j=7.1 hz, c6h)，6.52(1h, s, c1h)，6.34(1h, d, j=7.1 hz, c7h)，6.96(1h, brs, 经d2o交换后消失, —oh)，3.52(3h, s, c31h)，2.23(3h, s, c23h)，1.45(3h, s, c25h)，1.25(3h, s, c26h)，1.17(3h, s, c30h)，1.08(3h, s, c28h)，0.52(3h, s, c27h)。
4 讨论
4.1 本方法工艺简单、成本低，主要由丙酮提取、聚酰胺柱层析、硅胶柱层析3步完成：采用丙酮提取，体积分数75%甲醇洗脱，而且甲醇可以回收后反复使用，大大降低了成本；聚酰胺依次用5%naoh、h2o、10%ch3cooh洗脱后，也可以反复使用，为扁蒴藤素的工业化生产奠定了基础。
4.2 本方法不仅优化了提取工艺，而且对聚酰胺柱层析的主要工艺参数如洗脱剂、物料比等因素进行了详细的考察，使实验达到了低耗、高效的目的。
致谢：本文中13cnmr谱及1hnmr谱的测定由中国科学院南海海洋研究所完成，特此致谢。
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