慢性高尿酸血症大鼠模型建立方法的探讨
【关键词】 高尿酸血症;腺嘌呤;酵母;尿酸酶抑制剂;模型,动物;大鼠,wistar
【摘要】 目的 探讨慢性高尿酸血症大鼠模型的建立方法。方法 雌性wistar大鼠40只，随机分为对照组和模型组,模型组饲以高酵母饲料并给予腺嘌呤100 mg/(kg·d)灌胃,定期监测大鼠血尿酸水平，血尿酸水平开始下降时，改进造模方法，模型组饲以高酵母饲料，并以腺嘌呤溶液50 mg/(kg·d)灌胃，同时给予氧嗪酸钾乳悬液100 mg/(kg·d)分2次皮下注射，以维持大鼠高尿酸血症状态。结果 实验第14天始,模型组大鼠血尿酸水平均显著高于对照组(t=5.438～8.404,p<0.05)。结论 以高酵母饲料加腺嘌呤灌胃并适时给予氧嗪酸钾乳悬液皮下注射所复制的大鼠慢性高尿酸血症模型，具有血尿酸值高、维持时间长、模型稳定的特点。
【关键词】 高尿酸血症;腺嘌呤;酵母;尿酸酶抑制剂;模型,动物;大鼠,wistar
the method of creating a model of chronic hyperuricemia in rats zhang pei, miao zhimin, li changgui, et al (department of endocrinology, the affiliated hospital of qingdao university medical college, qingdao 266003, china); [abstract] objective to study the method of creating a model of chronic hyperuricemia in rats. methods forty female wistar rats were evenly divided into control group and model group in random. the rats in model group were administrated with adenine 100 mg/(kg·d) by gavage and yeastrich forage. blood ua, cr and bun were detected regularly. to improve the modeling method when serum uric acid levels started to decline. the rats were then administered with adenine, 50 mg/(kg·d), by gavage and yeastrich forage, and meanwhile, hypodermic injection of oxonic acid 100 mg/(kg·d), dividing into two doses, to maintain hyperuricemia. results beginning from 14th day of the experiment, the blood uric acid level of rats in model group was obviously higher than that of the controls (t=5.438-8.404,p<0.05). conclusion the rat model of hyperuricemia created by using yeastrich forage plus adenine and hypodermic injection of oxonic acid possesses advantages of high blood uric acid, longplaying maintenance, and stable.
[key words] hyperuricemia; adenine; yeast; uricase inhibitor; model, animal; rat, wistar
痛风是一种以血尿酸水平升高为特征的代谢性疾病，近年来，随着生活水平的提高，高尿酸血症和痛风的发病率逐年上升，痛风可以引发动脉平滑肌细胞增殖导致高血压[13];心脑血管病并发高尿酸血症的病人易诱发急性心肌梗死、中风,导致病死率增高[4]。Www.11665.COm作为代谢综合征的组分之一，高尿酸血症与代谢综合征的其他组分如：高血压、糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、肥胖、动脉粥样硬化等常并存而且相互影响[5]。因而研究高尿酸血症与代谢综合征其他组分的相互作用的机制及研制防治痛风和高尿酸血症的药物已成为当前医学界研究的热点，但慢性动物模型建立困难严重影响着研究工作的开展。本实验拟采用高嘌呤饮食和尿酸酶抑制剂相结合的方法，使用腺嘌呤、酵母、尿酸酶抑制剂复制大鼠慢性高尿酸血症模型，观察造模后受试动物血尿酸水平的变化，同时观察该模型对肾脏的损伤，为建立持续性高尿酸血症及痛风模型提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雌性wistar大鼠40只，体质量(170±20)g，由青岛市药检所提供，饲养于我院实验动物中心spf级动物饲养房，915 h日夜交替，普通大鼠颗粒饲料喂养，大鼠自由饮食饮水。
1.2 实验仪器和试剂
全自动生化分析仪(sysmex chemix180，日本);氧嗪酸钾(美国sigma公司);羧甲基纤维素钠(分析纯，中国上海亨达精细化学品有限公司);生化试剂(青岛益信医学科技有限公司);酵母干粉(安琪酵母有限公司);腺嘌呤(美国amresco公司)。
1.3 各种灌胃液及高酵母饲料的制备
1.3.1 羧甲基纤维素钠乳剂的制备 电子称量仪准确称取羧甲基纤维素钠粉剂，用生理盐水配成8 g/l乳状液。
1.3.2 氧嗪酸钾溶液的制备 使用电子天平准确称取氧嗪酸钾，用8 g/l羧甲基纤维素钠配成终浓度25 g/l的生理盐水乳悬液[6]。
1.3.3 腺嘌呤溶液制备 将腺嘌呤以蒸馏水溶解成4.0 g/l的悬浊液，置4 ℃冰箱备用。
1.3.4 高酵母饲料的制备 将酵母干粉均匀拌入粉碎的大鼠颗粒饲料中重新压粒成形,控制其在饲料中的质量分数为0.10。
1.4 实验分组及方法
大鼠适应性饲养7 d后，随机分为对照组20只、模型组20只。根据文献[7]的方法，模型组饲以质量分数0.10的高酵母饲料，并以100 mg/(kg·d)腺嘌呤溶液灌胃，以制备高尿酸血症模型;对照组饲以普通大鼠颗粒饲料，并给予同体积蒸馏水灌胃。每周监测血尿酸水平变化，第7周血尿酸水平开始下降时，改进造模方法，模型组饲以质量分数0.10的高酵母饲料，并以50 mg/(kg·d)腺嘌呤溶液灌胃，同时给予氧嗪酸钾乳悬液100 mg/(kg·d)分2次皮下注射，以维持大鼠高尿酸血症状态;对照组饲以普通大鼠颗粒饲料，并给予同体积蒸馏水灌胃，继续监测血尿酸水平。
1.5 实验指标检测
1.5.1 大鼠饮食、体质量等一般情况监测 每日观察两组大鼠进食情况、精神状态;每周监测大鼠体质量变化。
1.5.2 生化指标的监测 大鼠禁食14 h后，内眦静脉采血，分离出血清，在全自动生化分析仪上测定血尿酸(sua)、肌酐(cr)、尿素氮(bun)、三酰甘油(tg)、总胆固醇(tc)水平。
1.5.3 24 h尿量和尿的尿酸浓度测定 将大鼠放入大鼠代谢笼中24 h以收集尿液，自由饮水，记录24 h总尿量。然后将全部尿液混匀，留取5 ml，测尿酸浓度。
1.6 统计方法
应用spss 17.0及ppms 1.5[8]统计软件进行统计处理。
2 结 果
2.1 两组一般状态比较
随着造模时间的延长，模型组饮水量逐渐增加，最高饮水量达对照组的2～3倍;同时体质量逐渐下降，尿量逐渐增多，体毛干枯无光泽、精神委靡、活动减少等，严重者出现肌肉震颤、抽搐，衰竭而死亡，本组共死亡6只大鼠。对照组饮水量、尿量、体质量无明显变化，反应机敏，活动正常，体毛有光泽，无大鼠死亡。
2.2 两组血生化水平比较
2周后模型组大鼠血清sua水平明显升高，与对照组相比差异均有显著意义(t=5.438～8.404，p<0.05)。见表1。模型组大鼠3、10周的血清bun、cr、tc水平与对照组相比差异有显著性(t′=2.530～12.232,p<0.05)。见表2、3。
2.3 尿液变化
模型组3周后尿量逐渐增加，肾脏排泄尿酸功能减退，尿尿酸减少，同时尿密度减低，5周时与对照组相比差异均有显著性(t=5.553～18.296，p<0.05)。见表4。表1 两组大鼠不同时期血尿酸水平比较表2 两组大鼠3周时血生化水平比较表3 两组大鼠10周时血生化水平比较表4 高嘌呤饮食5周后大鼠24 h尿量、饮水量、尿密度及尿尿酸的比较(±s)组别24 h尿量(v/ml)24 h饮水量(v/ml)尿密度尿尿酸
2.4 病理变化
对照组大鼠肾脏外观无肿胀，色红有光泽，包膜易于剥离，肾小球、肾小管形态正常，皮质、髓质分界清楚。模型组大鼠肾脏体积增大，两肾呈灰白色，表面呈颗粒状，肾包膜与肾实质粘连不易剥离， 切面皮髓质分界不清。光镜检查：对照组肾小球囊腔内未见异常物质,肾曲小管、集合管亦未见异常病变。模型组部分肾小球萎缩，数量减少，肾小管浊肿,肾小管及间质部位有较多的尿酸盐结晶沉积, 结晶周围可见异物巨细胞反应，间质有灶性淋巴细胞浸润，个别区域有灶性纤维化;高倍镜下观察肾小管间质部位,可见尿酸盐结晶呈针状、双折光放射形排列。
3 讨 论
尿酸是人类嘌呤代谢的终产物，其血中浓度受遗传和环境两种因素的影响。原发性痛风的病因,除1%～2%的病人与先天性酶缺陷有关外,多数病因不明,但临床可见有相当一部分因进食高嘌呤饮食而诱发。高嘌呤饮食可使sua浓度升高,甚至达到相当于痛风病人的水平[9]。所以,高尿酸血症是痛风重要的生化基础,痛风危险性与sua水平有明显的相关性[1]。
近年来，高尿酸血症和痛风的发病率逐渐上升，发病年龄提前，对其病因学、流行病学、分子遗传学的研究渐成为热点。临床治疗正成为大家所关注的问题。高尿酸血症动物模型的建立，为开发研究验证治疗药物提供了一种有效途径，而至今国内外尚没有关于慢性高尿酸血症模型制备的统一报道，有待于进一步探讨。目前关于高尿酸血症动物模型的制备，国内外尚未有明确统一的方法，其中氧嗪酸钾作为体内尿酸酶的有效抑制剂用于制备高尿酸血症动物模型的方法因为灵敏、简便、重复性好，在国际上已普遍得到采用，但一般为短期造模。
本实验选用雌性wistar大鼠，联合应用酵母饲料饲喂、腺嘌呤灌胃和尿酸酶抑制剂皮下注射制备慢性高尿酸血症模型,观察sua水平及肾功能变化。实验第14天始,模型组sua水平均显著高于对照组,提示高尿酸血症模型制备成功。同时,模型组cr、bun水平亦高于对照组(p<0.05)。 实验第5周,肾脏切片光镜下可见肾小管浊肿,肾小管及间质部位有尿酸盐结晶沉积,间质有出血及大量炎性细胞浸润,所有这些病理特征与临床上高尿酸血症所致痛风性肾病较为相似。本实验联合应用酵母饲料饲喂、腺嘌呤灌胃和尿酸酶抑制剂皮下注射，可以使模型组sua水平明显升高且维持超过12周，可以成功制备大鼠慢性高尿酸血症动物模型,联合使用尿酸酶抑制剂前后模型组sua比较无统计学差异,高尿酸血症模型较稳定。此外，模型组大鼠tc明显高于对照组，这与临床上高尿酸血症和痛风病人易合并脂代谢紊乱相符合。
应该承认,目前尚无理想的动物模型问世。本实验结合应用几种模型,在时效性、稳定性方面有所改善，但仍存在不足。人体产生的尿酸约有2/3经肾脏随尿液排除,因此,高尿酸血症必然影响到肾功能的减退[10]。本实验模型组大鼠出现尿酸盐肾脏沉积现象，导致肾脏排泄尿酸功能减退，尿尿酸减少以及尿量增多、尿密度减低，结合肾脏免疫组化染色光镜下肾小管浊肿,肾小管及间质部位有较多的尿酸盐结晶沉积，考虑肾小管浓缩功能受损。如何建立与人体尿酸代谢异常相似的动物模型,深入开展痛风和高尿酸血症动物模型的研究,成为当前痛风研究中亟待解决的问题。
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