二氮嗪恢复缺血预处理对老年大鼠心肌的保护作用
【关键词】 老年;缺血预适应;一氧化氮;二氮嗪
【摘要】 目的 探讨二氮嗪(dz)对经缺血预适应(ipc)后的老年大鼠缺血再灌注(i/r)心肌的影响及可能机制。方法 取老年和青年wistar大鼠，建立离体心脏langendorff灌注模型，分7组(每组8只)：青年对照组、青年i/r组、青年ipc组、老年对照组、老年i/r组、老年ipc组、老年dz组。对照组全心灌流90 min。i/r组心脏灌流30 min后，缺血30 min，再复灌30 min。ipc组灌流10 min，经2次缺血5 min再灌注5 min后，缺血30 min，再复灌30 min。dz组灌流10 min，给予含dz(100 μmol/l)的kh液灌注20 min，余同ipc组。比较各组复灌30 min后心排血量(co)、左室发展压 (lvdp)、左室内压最大上升和下降速率 (±dp/dtmax) 的恢复率;检测缺血前及复灌30min后冠脉流出液中肌酸激酶 (ck) 活性及一氧化氮(no)含量和心肌中丙二醛 (mda)、超氧化物歧化酶 (sod) 的含量。结果 青年大鼠中，ipc组与i/r组比较，ck生成明显减少，no含量明显增加，mda含量明显降低，sod含量明显增加，co、lvdp、+dp/dtmax、dp/dtmax恢复率明显增加(p<0.01)。wWw.11665.cOM而在老年大鼠中，ipc组与i/r组比较上述指标无明显统计学差异(p>0.05)，dz组与i/r组比较有明显统计学差异 (p<0.05或p<0.01)。结论 ipc对老年大鼠i/r心肌保护作用减弱，其机制可能与no信号通路表达受抑制有关，dz可恢复ipc对老年大鼠i/r心肌保护作用。
【关键词】 老年;缺血预适应;一氧化氮;二氮嗪
murry等〔1〕首次提出心肌缺血预适应(ipc)的观点，其对心肌的保护作用是迄今为止最强的机体内源性保护机制。但目前ipc对于老年大鼠心肌的作用如何观点不一致〔2〕，临床上也缺乏合理、有效的保护，所以该领域的研究具有十分重要的理论和临床意义。本文前期研究〔3〕表明，二氮嗪(dz)预处理可以产生与ipc近似的心肌保护作用;ipc对老年大鼠心肌保护作用减弱〔4〕。而dz对老年大鼠心肌的影响尚不清楚。本研究通过离体大鼠心脏灌注模型，给予dz干预措施，探讨dz干预对老年大鼠经ipc后心肌的影响，以探讨老年大鼠ipc作用减弱的机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂
dz(军事医学科学院北京赛德维康医药研究院惠赠)。肌酸激酶 (ck)试剂盒 (beckman)，一氧化氮(no)试剂盒、丙二醛(mda)和超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所)。其余试剂均为国产分析纯。心功能检测采用biopac 16导生理记录仪(cbi8000，usa)。全自动生化分析仪 (beckman)。
1.1.2 建立离体心脏langendorff灌注模型
麻醉采用腹腔内注射戊巴比妥 (5 mg/kg)，开胸前5min腹腔注射肝素500 u/kg，开胸后迅速取出心脏，置于4℃改良krebshenseleit (kh) 液中洗净血液，迅速转移、固定于langendorff灌流装置。结扎双侧肺静脉，以改良kh液行常规恒压 (80 mmhg) 灌流。改良kh 液成分 (mmol/l )：氯化钠118.0、氯化钾14.7、磷酸钾1.2、硫酸镁1.2、碳酸氢钠25.0、氯化钙1.25、葡萄糖10.0，ph 7.3～7.4，以95% o2～5% co2饱和，维持灌流液温度37℃。缺血再灌注(i/r)组心脏平衡灌流30 min后，缺血30 min，再复灌30 min。ipc组心脏平衡灌流10 min，经2次缺血5 min再灌注5 min后，缺血30 min，再复灌30 min。dz组心脏平衡灌流10 min，给予含dz(100 μmol/l)的kh液灌注20 min，余同ipc组。对照组全心灌流90 min，不做任何处理。
1.2 方法
1.2.1 实验动物及分组
wistar大鼠56只(购自中国医科大学实验动物中心)，其中21～23月龄(老年鼠)24只和4～5月龄(青年鼠)32只。分为7组(每组8只)：青年对照组、青年i/r组、青年ipc组、老年对照组、老年i/r组、老年ipc组、老年dz组。
1.2.2 左心功能恢复率
切开左心耳,将充水乳胶囊由此插入至左心室,囊内压力经特氟纶管传递至压力传感器，通过压力换能器输入biopac 16导生理记录仪。记录缺血前的左室发展压 (lvdp)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)，主动脉流量 (af) 和冠脉流量 (cf) 分别通过收集主动脉和冠脉流出液来获得，并计算心排血量 (co=af+cf) 作为正常对照，复灌30min后再次记录以上指标，并与心脏缺血前值进行比较。心功能恢复率以复灌后相对应缺血前对照值的百分率表示，即变化的百分率(%) = 复灌后值/缺血前值×100%。
1.2.3 冠脉流出液ck活性
取缺氧前和复灌30 min后的冠脉流出液,12 h内用全自动生化分析仪测定ck的活性，按使用说明书操作。
1.2.4 冠脉流出液no含量
采用硝酸还原酶法。应用721型分光光度计于波长530 nm处测量上清吸光度，据吸光度大小计算no含量，结果用每克匀浆蛋白中μmol数(μmol/gprot)表示。
1.2.5 心肌组织中mda、sod含量
取0.5 g心室肌制成10%组织匀浆，mda采用硫代巴比妥酸比色法，sod采用黄嘌呤氧化酶法，具体操作步骤按mda 和sod 测试盒说明书进行。
1.3 统计学分析
应用spss13.0统计软件，计数资料用率表示;计量资料数据以x±s表示，组间比较用方差分析。
2 结 果
2.1 左心功能恢复率
各组缺血前基础值经方差分析无显著性差异(p>0.05)。在青年大鼠中，ipc组的co、lvdp、+dp/dtmax、dp/dtmax恢复率均优于i/r组，两组比较有显著性差异(p<0.01)。在老年大鼠中，ipc组与i/r组比较，左心功能恢复率无显著性差异(p>0.05),而dz组与i/r组比较有显著性差异(p<0.01)。见表1。
2.2 冠脉流出液ck活性的变化
各组缺血前基础值经方差分析无统计学差异(p>0.05)。青年大鼠中，ipc组ck活性与i/r组比较明显降低(p<0.01)。在老年大鼠中，ipc组与i/r组ck活性比较无明显降低(p>0.05)，而dz组与i/r组比较有显著性差异(p<0.01)。见表2。
2.3 冠脉流出液no含量变化
青年大鼠中，ipc组与i/r组比较，no含量明显增加(p<0.01)。在老年大鼠中，ipc组与i/r组比较no含量无明显增加(p>0.05),而dz组与i/r组比较，no含量明显增加(p<0.01)。见表2。
2.4 心肌组织中mda、sod含量的变化
青年大鼠中，ipc组与i/r组比较，mda活性明显降低、sod含量明显增加(p<0.01)。在老年大鼠中，ipc组与i/r组比较无明显变化(p>0.05),而dz组与i/r组比较，mda活性明显降低(p<0.05)、sod含量明显增加(p<0.01)。见表2。表1 左心功能恢复率表2 冠脉流出液中ck活性和心肌组织中mda、sod含量
3 讨 论
心肌i/r的重要机制是氧自由基损伤和钙超载学说，i/r发生后，氧自由基的产生与抗氧化系统失去动态平衡,氧自由基清除系统受到损伤，sod等活性下降,细胞内钙超负荷以致细胞膜受损,氧自由基生成增多,而氧自由基具有很强的氧化能力,可使膜脂质过氧化产物mda产生增加，加重细胞损伤、心肌细胞肿胀、线粒体产能障碍〔5〕。心肌组织中mda升高，sod活性下降常用来衡量细胞损伤的程度。本研究结果显示：ipc使青年大鼠经i/r后的心肌损伤明显减轻，表现为冠脉流出液ck生成明显减少，心肌组织mda含量明显降低，sod含量明显增加，左心功能恢复率明显增加。而在老年大鼠中，ipc未使i/r后的心肌损伤减轻，而dz干预使i/r后的老年大鼠心肌损伤减轻。提示ipc对青年大鼠有抗再灌注损伤作用，可以降低心肌酶活性，改善再灌注期间的心功能，促进心功能的恢复，还能提高清除氧自由基的能力，减少脂质过氧化物的形成,从而抑制氧自由基介导的心肌细胞损害减轻缺血再灌注损伤;而同等条件的ipc对老年大鼠i/r心肌无明显的保护作用，dz可以恢复ipc对老年大鼠i/r心肌的保护作用。
本研究还观察到青年大鼠中，ipc组与i/r组比较，no含量明显增加。在老年大鼠中，ipc组与i/r组比较no含量无明显增加,而dz组与i/r组比较，no含量明显增加。no作为重要的信号分子，参与了心肌肥大、心肌细胞凋亡、i/r以及ipc等过程，在调节心脏功能中起重要作用〔6〕。因此推测ipc对老年大鼠i/r心肌保护作用减弱，其机制可能与no信号通路表达受抑制有关，缺血前给予dz干预可能激活no信号通路，继而恢复ipc对老年大鼠i/r心肌的保护作用。
ipc信号传导途径机制即触发物质中介物质效应物质已被人们所接受〔7〕。既往研究〔3〕表明，ipc对心肌线粒体有保护作用，这一作用可能与线粒体辅激活因子过氧化物酶体增生激活受体γ协同刺激因子1α(pgc1α)激活及高表达有关。pgc1α的表达主要表达于耗氧较多且能量需求较高的器官和组织,如心、骨骼肌、棕色脂肪组织、肾、肝、脑等,在适应性产热、线粒体生成、脂肪酸β氧化及肝糖异生均有重要作用〔8〕。stpierre等〔9〕发现，在心肌细胞中体内pgc1α强表达可激活线粒体生物合成、氧化磷酸化及呼吸作用。leone等〔10〕证实，敲除pgc1α的裸鼠，其体内组织中氧化代谢功能有明显的缺陷，心肌收缩功能下降，还观察到心率异常及左心室功能受损。这些研究均表明pgc1α在心肌细胞中能量内环境平衡是必需的。pgc1α与心脏的能量代谢以及与心脏能量代谢紊乱所致病变的关联研究开始引起人们的极大关注〔11〕。近来研究〔12〕证实，no可通过可溶性鸟苷酸环化酶信号途径提供棕色脂肪细胞中pgc1α的表达，进而促进线粒体的生物合成，但no在心肌细胞中是否具有同样作用还不清楚。no还可通过调节兴奋收缩耦联和线粒体呼吸直接调节心肌细胞的收缩功能〔13〕。最近的研究认为，线粒体自身也存在no合酶，可产生no，也提示了no在调节线粒体功能方面的重要作用〔14〕。不同的代谢通路中，pgc1α上游受不同蛋白或其他信号分子作用,下游又能作用于其他的转录因子及rna 加工因子。推测no可能是心肌细胞pgc1α的上游信号物质，参与dz心肌保护机制的触发过程，pgc1α激活后与线粒体一系列受体结合，并与其他信号转导通路产生交叉作用，激活线粒体呼吸链改善线粒体能量代谢而产生心肌保护作用。而老年心肌细胞no信号通路表达受抑制，进而影响pgc1α的表达，使ipc对老年大鼠心肌的保护作用减弱，而dz干预可能使老年大鼠心肌线粒体敏感性钾通道处于较为理想的状态，或通过其他机制提高老年心肌对ipc的敏感性，从而恢复ipc对老年大鼠i/r心肌保护作用。至于其中的具体机制及相互联系尚需进一步实验证实。
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