侧脑室注射吡咯喹啉醌对大鼠学习记忆的影响
【关键词】 pqq;学习记忆;海马
【摘要】 目的 观察吡咯喹啉醌(pqq)对大鼠学习记忆能力的影响。方法 侧脑室注射pqq，60 d后用水迷宫仪进行定位航行和空间探索实验，行脑组织切片，用免疫组化法和western印迹观察海马组织巢蛋白、神经生长因子及其受体的表达。结果 与对照组相比，pqq处理后，大鼠学习找平台所需的次数减少和找到平台所需的时间显著缩短，在第一象限和中环停留的时间显著延长，此变化呈剂量依赖性;海马组织巢蛋白阳性神经元数目增加了，神经生长因子的表达高于对照组。结论 pqq能促进鼠海马神经细胞的生长发育和学习记忆能力。
【关键词】 pqq;学习记忆;海马
【abstract】 objective to investigate the effects of pyrroloquinoline quinone (pqq) on the learning and memory performance of rats. methods pqq was administered into the rat lateral ventricle. after 60 days the rats were enforced the place navigation and the probe trial. the protein expression of nestin was detected by immunohistochemical staining. the expression of nerve growth factor (ngf) and its receptor trka were detected by western blot. results in the pqq groups, the frequency of learning to find platform was less and the latency was shorter than that of control group significantly, the dwell time in platform in quadrant 1 and mist ring were longer than those of control group, which were in a dosedependent on pqq. in the pqq group the numbers of positive neuron cell contained the nestin protein in hippocampal tissue were more than those of control group. pqq could irritate the expressions of ngf and its receptor trka. conclusions pqq could improve the growth and development of hippocampal tissue and the learning and memory performance of rats.
【key words】 pyrroloquinoline quinone (pqq); learning and memory performance; hippocampus
吡咯喹啉醌(pqq) 作为氧化还原酶辅酶参与生物机体多种氧化还原反应，它存在于植物、动物体内，人体组织和体液中也存在微量pqq。WwW.11665.Compqq还具有重要的生物活性和功能，如刺激微生物、人体细胞生长和植物发育〔1〕;影响鼠肝脏线粒体成分的含量和功能及糖和氨基酸的代谢〔2〕;pqq及其衍生物刺激离体培养的神经细胞、神经胶质细胞和活体鼠脑合成和释放神经生长因子(ngf)〔3〕;在离体的条件下，连接于淀粉纤维上，防止神经淀粉纤维瘢痕的形成〔4〕;降低由6羟基多巴胺介导的自由基产生以降低其神经毒性作用〔5〕，降低由大脑中动脉阻塞引起的神经组织的坏死和行为障碍〔6〕。本研究行侧脑室注射pqq，观察pqq对大鼠学习记忆能力的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
pqq(sigma公司)以生理盐水溶解，兔源的抗胆碱乙酰基转移酶(chat)、巢蛋白(nestin)和酪氨酸激酶(trka)(武汉博士德公司)，抗ngf，羊抗兔二抗(北京中杉金桥)，1月龄雄性的wistar大鼠40只(郧阳医学院动物中心提供)。
1.2 方法
1.2.1 实验分组
将1月龄雄性的wistar大鼠40只，随机分为4组，每组10只，1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，切开头皮，于人字缝前1.5 mm，旁开1.8 mm，深4 mm处行侧脑室注射。①正常对照组：侧脑室注射生理盐水20 μl，每10天一次。②侧脑室注射小剂量pqq组：侧脑室注射pqq 10-5mol/l 20 μl，每10天一次;③侧脑室注射较大剂量pqq组：侧脑室注射pqq 10-4mol/l 20 μl，每10天一次。④侧脑室注射大剂量pqq组：侧脑室注射pqq 3×10-3mol/l 20 μl，每10天一次。1 min内注射完毕，留针2 min。
1.2.2 神经行为学检测定位航行实验和空间探索实验
取用药后60 d的大鼠置于120 cm的圆形水箱中，计算机软件将圆桶以圆点为中心，等分为内中外三个环，平台置于中环;以圆点画“+”将圆桶等分为四个象限，以平台所在处为第一象限，顺时针走向分别为第二、第三和第四象限，水温22℃，水为乳白色，平台置于水面下2 cm处。动物学习找水面下的平台：先将动物置于平台上6 s，然后将动物抛于水中，让大鼠自已找平台，如2 min内没找到平台，则再将动物置于平台上6 s后再抛入水中，至动物能自已在2 min内找到平台为止，并记录动物学习找平台所需的次数。2 d后进行应用morris水迷宫仪，进行定位航行实验，将大鼠放于水箱中，记录大鼠在2 min内找到水面下平台所需要的时间(潜伏期)。撤掉迷宫仪中平台，进行空间探索实验，观察鼠在2 min内在迷宫中寻找平台的运行轨迹。
1.2.3 海马组织切片的制作
取用药后60 d的大鼠，麻醉后经左心室灌注生理盐水和4%多聚甲醛，断头取脑，置于固定液中固定，石蜡包埋，连续石蜡切片，切片厚度8 μm以备用。
1.2.4 western印迹分析ngf和trka蛋白的表达
取用药后60 d的大鼠，断头、取海马组织和基底前脑组织，置于细胞裂解液中裂解细胞，离心取上清，配制12%分离胶和5%浓缩胶，每孔加入50 μg蛋白质样品置电泳缓冲液中，100 v电压，当样品跑至浓缩胶和分离胶界面，将电泳电压换成200 v电泳至所需时间，将电泳后的蛋白质转至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h，分别加一抗4℃孵育过液，再加二抗室温孵育2 h，三羟甲基丙烷(tmp)显色剂显色。
1.2.5 免疫组化分析nestin蛋白、trka的表达
取切片厚度8 μm的石蜡切片，二甲苯脱蜡，加兔源的抗nestin和trka抗体(1∶50)4℃孵育过夜，滴加羊抗兔igg 30 min，二氨基联苯胺(dab)显色，苏木素复染。
2 结 果
2.1 定位航行和空间探索实验结果
与对照组相比，pqq处理后，大鼠学习找平台所需的次数减少和找到平台所需的时间显著缩短;各处理组鼠在第一象限停留的时间显著长于其他象限，于第三象限停留的时间短于其他象限，于中环停留长于内环和外环，而pqq处理组大鼠在第一象限和中环停留的时间又显著长于对照组。见表1。
2.2 免疫组化分析海马组织巢蛋白的表达
对照组海马组织切片可见少许散在点状细胞胞浆出现黄色免疫反应物，而pqq处理组海马组织可见较多的细胞胞浆出现黄色或棕黄色免疫反应物。见图1。图1 海马组织 ca2区巢蛋白的表达(×100)2.3 western印迹分析海马组织ngf和脑基底组织trka的表达 和对照组相比，经pqq处理后海马组织ngf和脑基底组织trka的表达增强。见图2。1为对照组，2为pqq 10-4 mol/l组，3为pqq 10-3 mol/l组图2 海马组织ngf和基底前脑trka的表达
2.4 免疫组化分析基底前脑trka蛋白的表达
对照组基底前脑组织切片可见黄色免疫反应物出现在细胞膜上，少许散在出现细胞胞浆中，而pqq处理组细胞膜和胞浆出现黄色或棕黄色免疫反应物，且显著多于对照组。见图3。表1 各组定位航行和空间探索实验结果图3 免疫组化分析基底前脑组织trka蛋白的表达(×100)
3 讨 论
实验结果显示，各处理组鼠在平台所在处停留的时间显著长于非平台所在处，在远离平台所在处停留的时间显著缩短，而pqq处理组大鼠更甚，提示各处理组鼠有一定的学习记忆能力，pqq处理组大鼠的学习记忆能力更强;与对照组相比，pqq处理后，大鼠学习找平台所需的次数减少和找到平台所需的时间显著缩短，提示pqq能增强大鼠的学习记忆能力。资料显示，在与学习记忆有关的脑区中，海马组织的作用显得特别突出，海马组织的生长发育、体积的大小、神经元的结构、突触的形态以及神经元胆碱乙酰基转移酶的表达等与学习记忆均有明显的相关性。本文前期研究表明，侧脑室注射pqq后，海马各个区的厚度增加，神经细胞密度、体积大于对照组，提示pqq可促进在体的海马神经细胞生长发育的作用〔7〕。另外，pqq可促进海马细胞巢蛋白的表达，而巢蛋白是神经干细胞的标志蛋白，神经干细胞具有分裂增殖的能力，pqq处理后海马组织表达巢蛋白的细胞增多，提示pqq可能促进海马组织神经干细胞的分裂增殖，致使海马组织细胞的密度增加。已有资料显示，低浓度pqq能刺激培养的人成纤维细胞dna合成，细胞的密度增加，其促生长作用强于成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子，与上皮细胞生长因子相当〔8〕;细胞的线粒体在调节细胞的生长和分化起着重要的作用〔9，10〕，线粒体呼吸链的缺乏将影响与细胞周期相关蛋白质的表达，细胞周期相关蛋白质含量的变化可影响细胞的增殖速率〔11〕，而细菌的pqq和醌蛋白在不消耗能量条件下可直接参与底物氧化反应，形成截短的呼吸链而产生能量，pqq能增加线粒体dna的含量和细胞色素酶c的活力而影响生物体的物质代谢〔12〕。pqq是否直接或通过某些途径影响到周期蛋白的表达，以至影响海马神经干细胞生长增殖还有待于进一步的探讨。本研究显示，pqq能促进ngf和基底前脑trka受体的表达，而ngf可作用于trka受体对神经元的生长发育起促进作用，特别是对胆碱能神经元的胞体和突起的生长、存活、功能的维持发挥营养作用，并促进其表达chat〔13〕。前期研究表明〔7〕，pqq处理后海马组织神经元和神经纤维的chat的表达增强，chat促胆碱能神经元合成乙酰胆碱，促进胆碱能神经元突触传递功能，而促进机体的学习与记忆功能。pqq作为新的维生素受到人们的关注，其营养性和药理学作用有待于进一步的探讨。
【参考文献】
1 steinberg f,stites te,anderson p,et al.pyrroloquinoline quinone improves growth and reproductive performance in mice fed chemically defined diets〔j〕.exp bio med,2003;228(2):1606.
2 bauerly ka，storms dh，harris cb,et al.pyrroloquinoline quinone nutritional status alters lysine metabolism and modulates mitochondrial dna content in the mouse and rat〔j〕.biochim biophys acta，2006;1760(11):17418.
3 bishop a，gallop pm，karnovsky ml.pyrroloquinoline quinone：a novel vitamin〔j〕? nutr rev，1998;56(10):28793.
4 kobayashi m，kim j，kobayashi n,et al.pyrroloquinoline quinone(pqq) prevents fibril formation of alphasynuclein〔j〕.biochem biophys res commun，2006;349(3):113944.
5 hara h，hiramatsu h，adachi t.pyrroloquinoline quinone is a potent neuroprotective nutrient against 6hydroxydopamineinduced neurotoxicity〔j〕.neurochem res，2007;32(3):48995.
6 zhang y，feustel pj，kimelberg hk.neuroprotection by pyrroloquinoline quinone (pqq) in reversible middle cerebral artery occlusion in the adult rat〔j〕.brain res，2006;1094(1):2006.
7 熊顺华，郭青平，王 燕.侧脑室注射吡咯喹啉醌对大鼠海马组织的促生长作用〔j〕.中国老年学杂志，2008;28(1):157.
8 naito y，kumazawa t，kino i,et al.effects of pyrroloquinoline quinone(pqq) and pqqoxazole on dna synthesis of cultured human fibroblasts〔j〕.life sci，1993;52(24):190915.
9 rochard p，rodier a，casas f，et al.mitochondrial activity is involved in the regulation of myoblast differentiation through myogenin expression and activity of myogenic factors〔j〕.j biol chem，2000;275(4):273344.
10 spitkovsky d，sasse p，kolossov e,et al.activity of complex iii of the mitochondrial electron transport chain is essential for early heart muscle cell differentiation〔j〕.faseb j，2004;18(11):13002.
11 schauen m，spitkovsky d，schubert j，et al.respiratory chain deficiency slows down cellcycle progression via reduced ros generation and is associated with a reduction of p21cip1/waf1〔j〕.j cell physiol,2006;209:10312.
12 stites t，storms d，bauerly k，et al.pyrroloquinoline quinone modulates mitochondrial quantity and function in mice〔j〕.j nutr，2006;136(2):3906.
13 german dc，yazdani u，speciale sg,et al.cholinergic neuropathology in a mouse model of alzeimer′s disease〔j〕.j comp neurol，2003;462(4):37181.
