【摘要】  以泰乐菌素为虚拟模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，合成了对替米考星具有高选择性的分子印迹聚合物。考察了二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮和氯仿4种致孔剂对合成聚合物性能的影响。通过正交实验优化的聚合配方为：1.0 mmol泰乐菌素，8.0 mmol甲基丙烯酸，20.0 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯，6.0 ml氯仿，20.0 mg偶氮二异丁腈。研究了将该聚合物作为固相萃取填料分离、富集替米考星的萃取条件和萃取性能。当萃取柱依次用甲醇和水（ph 9.0）活化，乙腈溶液上样，甲醇和氯仿分别洗涤，3 ml氨化甲醇（95∶5，v/v）洗脱时，替米考星在分子印迹固相萃取柱上的回收率达到90%以上，而非分子印迹固相萃取柱的回收率仅为32％。

【关键词】  分子印迹聚合物；替米考星；固相萃取；虚拟模板

           preparation of tilmicosin imprinted polymers and　its application to solid phase extractionzheng ya-qiu，cao zhan，guo hong-bin，zhang qing-jie，he li-min*，chen qing-ju，luo biao(department of pharmacology，college of veterinary medicine，south china agricultural university，guangzhou 510642)abstract  molecularly imprinted polymers(mips) with high selectivity to tilmicosin(tim) were prepared using tylosin(tyl) as dummy template，methacrylic acid(maa) as monomer，ethylene glycol dimethacrylate(egdma) as cross-linker.the effects of 4 porogens including dimethyl formamide，methanol，acetone，and chloroform on the recognition capability of mips were investigated.orthogonal test was used to optimize the preparation of mips，and the optimal composition was as follows: 1.0 mmol tyl，8.0 mmol maa，20.0 mmol egdma，6.0 ml chloroform，20.0 mg azobisisobutyronitrile.the solid phase extraction conditions and characteristics of mips as adsorptive material for the selective extraction and enrichment of tim were also studied.the recovery of tim was above 90% when the following procedure was applied to mips cartridge: conditioning with methanol and water(ph 9.0)，loading with acetonitrile，cleaning with methanol and chloroform respectively，and eluting with 3 ml methanol-ammonia(95∶5，ｖ/ｖ).the recovery of tim on non-imprinted polymers cartridge was only 32%.

　　keywords  molecularly imprinted polymers； ｔilmicosin； ｓolid-phase extraction； ｄummy template

　　1  引言

　　替米考星（tilmicosin，tim）是一种由泰乐菌素(tylosin，tyl)半合成制得的大环内酯类畜禽专用抗生素，具有同其它大环内酯类药物相似或更强的抗菌活性，目前广泛用于预防和治疗牛、羊、猪和鸡等动物由敏感菌引起的感染性疾病，特别是畜禽呼吸道感染[1]。wWW.11665.com考虑动物性食品安全，欧盟、美国和日本等都对该药制定了较低的最高残留限量，我国农业部公告第235号也制定了tim的最高残留限量牛、羊和猪的脂肪肝、肾中分别为50，1000和1000 μg/kg；羊奶中为50 μg/kg；鸡的肌肉、皮脂、肝和肾中分别为75，75，1000和250 μg/kg。提高样品净化方法的选择性一直是痕量分析研究的重要方面，近年来用分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，mips)作为填料的固相萃取受到广泛关注[2～５]。与传统的固相萃取填料相比，mips兼具生物吸附材料的选择性和常规填料的理化稳定性[６]。但由于模板分子难以完全除去，限制了mips在痕量分析中的应用，“虚拟模板”的应用很好地解决了这一问题[7，８]。本实验以与tim结构相似的tyl为虚拟模板分子（图1），合成的mips对tim具有良好识别性能。将制备的mips作为固相萃取填料，对tim具有很高的选择性，为生物样品中替米考星残留的分离、纯化提供了基础。

　　图1  替米考星与泰乐菌素的化学结构式（略）

　　fig.1  chemical structural formula of tilmicosin(tim) and tylosin(tyl)

　　2  实验部分

　　2.1  仪器与试剂waters2695-2487型高效液相色谱仪(美国waters公司)；xl-30型环境扫描电子显微镜(荷兰菲利浦电子光学有限公司)；sha-b型恒温水浴振荡器(常州国华电器有限公司)。

　　替米考星标准品（含量≥98.5%，dr.ehrenstorfer公司）；泰乐菌素标准品（含量≥90%，sigma-aldrich公司）；泰乐菌素原料（含量≥90%，西安亨通光华制药有限公司），使用前用甲苯重结晶；甲基丙烯酸(methacryclic acid，maa， 分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心）；乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene glycol dimethacrylate，egdma， 98％，sigma-aldrich公司)，使用前用活性炭吸附除去阻聚剂；偶氮二异丁腈(azobisisobutyronitrile，aibn ， 化学纯，天津市科密欧化学试剂开发中心），使用前用甲醇重结晶；甲醇、乙腈、二甲基甲酰胺、丙酮、氯仿和乙酸铵均为色谱纯；其它试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

　　2.2  mips的制备

　　2.2.1  不同致孔剂的mips的制备  分别将1.0 mmol tyl溶解于6 ml二甲基甲酰胺、甲醇、丙酮和氯仿中，加入4.0 mmol maa，超声混合5 min，4 ℃预聚合4 h。然后加入20.0 mmol egdma和40.0 mg aibn，超声5 min，于冰浴上吹高纯氮气5 min，密封，60 ℃水浴聚合24 h，得到块状聚合物。将聚合物研磨、过筛(粒度为38～75 μm)，用丙酮反复沉降以除去细小颗粒。然后装入15 mm×200 mm玻璃层析柱，用甲醇-乙酸（9∶1，v/v）溶液200 ml洗涤去除模板，流速控制在1 ml／min以内，再用100 ml甲醇洗去乙酸，真空干燥12 h，备用。

　　非印迹聚合物(non-imprinted polymers，nips)除不加模板分子外，其它步骤同上。

　　2.2.2  正交实验设计  以氯仿为致孔剂，固定模板分子tyl为1.0 mmol，考察maa用量(a)、egdma用量(b)、氯仿用量(c)和aibn用量(d)4个因素，进行l9(34)正交实验。通过固相萃取加标回收实验，分析各因素对聚合物性能的影响，获得最优合成配方。

　　2.3  固相萃取实验

　　2.3.1  分子印迹固相萃取柱的制备及萃取条件优化    称取150 mg mips于体积为3 ml带有滤板的聚丙烯空柱中，制成分子印迹固相萃取(molecularly imprinted solid phase extraction，mispe)柱。考察不同的活化、上样、淋洗和洗脱条件下mispe柱对tim的保留能力。tim的上样浓度为10.0 mg/l， 上样2 ml，收集洗脱液，吹干后溶解于2 ml甲醇中，用hplc测定。同时用nips制备非印迹固相萃取（non-imprinted solid phase extraction，nispe）柱做对照实验。

　　2.3.2   mispe的选择性实验  将tim和tyl溶于乙腈，制备浓度为10.0 mg/l的混合标准溶液，上样2 ml，分别收集mispe柱的洗涤和洗脱组分，吹干后溶解于2 ml甲醇中，用hplc测定。

　　2.4  色谱条件

　　色谱柱：agilent extend-c１8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1 ml／min；柱温：30 ℃；进样量： 10 μl； 检测波长： 287 nm； 流动相： 0.1 mol／l乙酸铵溶液(a)-乙腈(b)， 梯度洗脱程序为： 0 min， 20%b； 2.5 min， 48%b； 4.5 min， 48%b； 4.6 min， 20%b。

　　3  结果与讨论

　　3.1  聚合条件的优化

　　3.1.1  致孔剂的选择  用扫描电镜对4种致孔剂合成的聚合物进行结构表征。从放大8000倍的聚合物表观形态图（图2）可以看出，以甲醇为致孔剂的聚合物结构松散；以丙酮和氯仿为致孔剂的聚合物结构比较致密，有大量孔穴；以二甲基甲酰胺为致孔剂的聚合物结构致密，表面光滑。

　　图2  不同致孔剂制备的分子印迹聚合物的扫描电镜图（×8000）（略）

　　fig.2  scanning electron micrographs of molecularly imprinted polymers(mips) prepared by different porogens（×8000）

　　a.二甲基甲酰胺(dimethyl formamide，dmf)； b.甲醇(methanol)； c.丙酮(acetone)； d.氯仿(chloroform)。

　　由回收率结果（表1）可以看出，以丙酮和氯仿为致孔剂的mips吸附保留性能好，但以丙酮为致孔剂的nips回收率也达到78％，非特异性吸附较强。因此，本实验确定以氯仿为致孔剂。董文国等[9]通过1h-nmr实验表明：不同致孔剂中合成的聚合物识别能力的差异源于其在不同溶剂环境中形成氢键的能力有差别，用弱极性氯仿制备的mips的游离羧基和tim可能形成较强的氢键。

　　表1  不同致孔剂聚合物的tim固相萃取回收率(n=3)（略）

　　table 1  solid-phase extraction recoveries of tilmicosin(tim) by polymers prepared in different porogens(n=3)

　　mispe：分子印迹固相萃取（molecularly imprinted solid-phase extraction）；nispe：非印迹固相萃取（non-imprinted solid-phase extraction）；sd：标准偏差（standard deviation）。

　　3.1.2  正交实验结果分析  采用极差法（r值）分析正交实验数据，结果见表2。从对回收率指标影响考虑，在4个考察因素中，影响最大的为交联剂用量(b)，最优合成配方为a3b1c2d1。按此组合制备的mips固相萃取回收率达到97%。但该聚合物质地软，在固相萃取过程中流速慢，重复使用时，结果不稳定，非特异性吸附强。这可能因为交联剂用量少，聚合物在洗脱模板分子后，无法保持孔穴原来的形状和大小，使结合位点发生变化。因此考虑适当增加交联剂用量，使聚合物的刚性增强。固定其它物质的量，增加egdma用量。结果如图3所示，当egdma用量为20.0 mmol时，所制得的聚合物刚性适中，特异性强，回收率较高，具有良好的重复性。因此，综合考虑mispe的回收率、稳定性、特异性等因素，本实验最终确定mips的合成配方为：1.0 mmol tyl，8.0 mmol maa，20.0 mmol egdma，6.0 ml氯仿，20.0 mg aibn。 

　　图3  交联剂用量对聚合物吸附性能的影响（略）

　　fig.3  effect of amounts of cross-linker on the adsorption properties of polymers prepared

　　表2  正交实验的结果及分析（略）

　　table 2  results and analysis of orthogonally designed test

　　3.2  mispe的优化

　　3.2.1  活化溶剂的选择  依次用甲醇和不同ph值的水（5.0，7.0和9.0）活化mispe柱，并用nispe柱作对照。结果表明，mispe柱的回收率均在90％以上。但只有用ph 9.0的水活化的特异性强，nispe柱的回收率仅为32％。这可能是因为弱碱性条件下有利于聚合物与目标分子之间形成氢键，从而增强了识别的特异性。

　　3.2.2  上样溶剂的选择  分别用４种有机溶剂（二甲基甲酰胺、乙腈、丙酮及氯仿）和纯水作为tim的溶解介质上样。结果如表3所示，以乙腈、丙酮和氯仿为溶剂时，mispe的回收率都达到90％以上； 而nispe回收率在40％以下，回收率和特异性都较好。考虑到通常用乙腈提取实际样品中的tim，故本实验选择乙腈为上样溶剂。

　　表3  不同上样溶剂的tim回收率(n=3)（略）

　　table 3  recoveries of tim in different loading solvents(n=3)

　　3.2.3  洗涤溶剂的选择    分别测定了甲醇、乙腈及氯仿作为淋洗溶剂时的tim回收率，结果如表4。氯仿洗涤可获得满意的回收率且能除去大部分非特异性吸附。考虑到mispe应用到实际样品中，氯仿的净化效果不如甲醇，甲醇洗涤可以除去大部分杂质，且不影响回收率。因此，本实验采用甲醇和氯仿两次洗涤，既保证了mispe的净化效果，又不会影响mispe的选择性。

　　表4  不同洗涤溶剂的tim回收率(n=3)（略）

　　table 4  recoveries of tim in different washing solvents(n=3)

　　图4  tyl和tim典型色谱图（略）

　　fig.4  typical chromatograms of tyl and tim

　　a.tyl和tim标准溶液(standard solution of tyl and tim) 10.0 mg/l；b.氯仿洗涤部分(washing step with chloroform)；c.氨化甲醇洗脱部分(ｅluting step with methanol-ammonia) 95∶5，v/v。

　　3.2.4  洗脱液的选择  实验了3 ml不同比例的氨水-甲醇溶液（98∶2，97∶3，96∶4，95∶5，94∶6，92∶8，v/v）作为洗脱液的洗脱效果。结果表明，95∶5，94∶6及92∶8（v/v）的氨化甲醇溶液均可以有效洗脱mispe吸附的替米考星，回收率达到90％以上。但氨水的比例过大会影响洗脱液吹干，本实验选择3 ml氨化甲醇（95∶5，v/v）为洗脱液。

　　3.3  mispe的选择性

　　由mispe选择性实验典型色谱图（图4）可以看出，氯仿洗涤一步，tyl被洗涤下来，而tim仍然保留在mispe柱上；用3 ml氨化甲醇洗脱，tim回收率为91.3%，说明tim与mispe柱结合较强。根据分子印迹的原理，模板分子一般在相应的印迹聚合物上的保留是最强的。但在一定条件下，模板类似物的保留可能比模板分子更强[10，11]。这是由于模板类似物与模板分子结构非常相似，且模板类似物与功能单体之间的相互作用力大于模板与功能单体之间的相互作用力。上述实验现象可能是tim的哌啶基团与制备的tyl-mips聚合物中特异识别位点的相互作用更强。

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