【摘要】 目的：对梭子蟹（portunus pelogicus(linnaeus)）变应原进行分离，鉴定其主要及次要变应原，采用蛋白纯化技术获取梭子蟹天然的主要变应原并进行鉴定，为标准化变应原疫苗的研制提供理论依据。方法：取常规方法制备梭子蟹浸出液，经sdspage分离，测定各组分的相对分子量；同时用26例对蟹过敏的病人血清进行western blot，鉴定其主要及次要变应原；利用快速制备液相色谱(fplc)纯化技术（凝胶过滤层析和离子交换层析）获取主要变应原并作鉴定。结果：sdspage显示梭子蟹有19条可辨蛋白带，分子量在13 000～90 000之间，其中主带有9条，分子量是20 900、24 200、27 100、29 200、33 700、38 900、48 700、74 700、89 100；western blot结果表明，26例蟹过敏患者血清全部呈阳性反应，浸出液中共有5条致敏条带，其中分子量在74 400、48 700的是主要变应原，阳性反应率均为100%；纯化后获取了74 400、48 700的主要变应原；经过免疫鉴定证实其具有免疫活性。结论：梭子蟹74 400和48 700的变应原为主要变应原，层析技术可以对分子量为74 400和48 700的主要变应原成分进行纯化。
【关键词】 梭子蟹 变应原 sdspage western blot fplc
purification, identification and characterization of the major allergen from linnaeus
zhao qihua, wang xizhong, chen lijin, li wen, liu yongping.
the second affiliated hospital of guangzhou medical college, guangzhou 510260, china
［abstract］ objective:to purify and characterize the major antigenic components of sand swimming crab,and provide theoretical evidences for the research of standardization of allergenic vaccine.methods:the crude extract of linnaeus was prepared using classical method, and electrophoresis of sdspage was used to separate the proteins of each group. the allergen proteins of 26 crab were identified using western blot. to distinguish between the primary allergen proteins and secondary allergen proteins, fplc(gel chromatography and ion exchange chromatography) was used to filtrate and identify the allergen protein.results:sdspage analysis revealed that sand swimming crab proteins were composed of at lease 9 discrete protein bands, which molecular weight ranging from 13 000 to 90 000. major bands were of 20 900, 24 200, 27 100, 29 200, 33 700, 38 900, 48 700, 74 700, 89 100 respectively. western blot assay indicated that the crude extract reacted with sera obtained from 26 crab allergenic subjects and contained 5 allergen bands altogether, and the bands of 74 400 and 48 700 were the major allergenic components. the positive rates of the two major allergen proteins were both 100%, indicating the allergenic components maintained the immunocompetence after yielding from chromatography.conclusion:the 74 400 and 48 700 bands are the major allergens of sand swimming crab. the major allergen proteins can be purified by chromatography.
［key words］ linnaeus；allergen proteins；sdspage；western blot；fplc
蟹是引起过敏的最常见的海产品之一，蟹的种类很多，在我国就有600多种，有梭子蟹、雪蟹、青蟹等等，是超敏反应人群中最主要的食物性因素之一。WwW.11665.cOm临床表现有腹痛、腹泻、呕吐、皮疹、鼻炎、头痛、血管性水肿、哮喘和威胁生命的过敏反应［1］。国外早有报道，职业性哮喘在雪蟹加工厂的工人中非常普遍，其皮试反应、血清中结合蟹提取物的特异性ige的升高与职业性哮喘存在显著的相关关系［2］。近年来，国外有资料报道，雪蟹第一个被鉴定的主要变应原的分子量是34 000［3］。也有报道显示，雪蟹的致敏蛋白条带是25 000～45 000、14 000或14 000以下，97 000、38 000～41 000［4］。梭子蟹俗名花蟹，属梭子蟹属，梭子蟹科，在动物分类上，属于节胶动物门甲壳纲，由于形似织布用的梭子和蟹壳呈花斑状而得名，是最常见的大型淡水经济蟹类，肉味鲜美，营养丰富，是人们的常见食品，在我国华南地区养殖业占有重要的地位。其变应原的纯化和鉴定国内外至今未见有报道。因此，我们选用梭子蟹进行分离纯化，获取梭子蟹天然的主要变应原，同时对其变应原特性进行鉴定，为标准化变应原疫苗的研制提供理论依据，以探讨对变态反应疾病更安全、更准确的诊断方法。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵、sds、四甲基乙二胺（temed）、tween20、羊抗人igehrp购自sigma；蛋白标准品、pvdf膜购自biorad；tris购自roche；deaeff（二乙氨乙基快速弱阴离子交换剂）、sephadex g100购自pharmacia；其它试剂为国产分析纯试剂。
1.2 主要仪器 fplc（安玛西亚中国有限公司aktl）；低温离心机（hereaus multifuge 3sr）；制冷机（grant fm70）；分光光度计（安玛西亚ultrospec 2100 pro）；真空冷冻干燥机（labloncol freezone 6升立式真空泵195）；凝胶成像系统（biorad huniversal hood ⅱs.n 76s/00417）；直流稳压器（biorad）；垂直板电泳槽（biorad miniprotean 3 cell）；转膜电泳槽（biorad minitransblot）。
1.3 梭子蟹的采集和粗浸液的制备 新鲜梭子蟹于中国水产研究所定点采购，参照乔秉善编《变态反应学实验技术》［5］。除去梭子蟹硬壳部分，用刀剁碎蟹肉后按其1∶2（w/v）的比例浸泡在95%酒精中脱水，在室温下搅动1～2小时后倒出上清液，加入新鲜溶剂，反复操作3次后，放37℃风干。把风干的蟹肉放组织搅碎机搅碎，过40目筛（孔径0.45 mm），除去材料中的杂质。用2∶1的丙酮和乙醚脱脂3次。按1 g加入提取缓冲液（ph 7.4）25 ml的比例提取蟹浸液，置冰箱4℃浸泡48小时，期间每日搅拌2小时。后经5 000 r/min离心15分钟，吸取上清，把上清透析、冻干备用。
1.4 血清来源与制备 以临床病史、皮试和unicap(pharmacia)检测为依据，选取2002年8月到2005年3月我科门诊蟹过敏病人26例。取无蟹过敏史、皮试和unicap(pharmacia)蟹检测阴性为对照。取其血液分离血清，分装，置-80℃保存。
1.5 方法
1.5.1 sdspage 参照文献［6］，采用不连续系统进行垂直板电泳，对蟹浸液组分进行分析。浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度12%。蛋白分子量标准购自biorad公司。样品(蛋白浓度为3 mg/ml)和上样缓冲液1∶2混合，煮沸3分钟，离心，取上清每孔上样15 μl。电泳电压采用100 v，待溴酚蓝指示剂达底部电泳完毕，用考马斯亮蓝染色过夜，用脱色液充分脱色后进行分子量测定。
1.5.2 western blot 依照文献［7］方法改良，梭子蟹浸出液通过sdspage电泳分离，电转移至pvdf膜上（biorad电转移系统），转膜后用丽春红染色，确证蛋白转到pvdf膜上。已转印的膜用封闭液封闭，后依次加一抗（病人血清）和二抗（羊抗人igehrp）孵育，采用二氨基联苯胺（dab）显色，其间每次操作膜都漂洗干净。
1.5.3 凝胶过滤层析 根据western blot结果分析，选取sephadex g100凝胶过滤层析，除去非致敏蛋白［8］。柱长25 cm，直径1.6 cm，流动相0.05 mol/l磷酸盐缓冲液（ph 6.4）。先用2倍柱体积的流动相平衡柱子，取15 mg的梭子蟹浸出液冻干粉溶于1.5 ml的流动相，8 000 r/min离心20分钟，取上清液进样，以0.3 ml/min的流速洗脱，收集各峰样品电泳分析，并将各峰样品用双蒸水透析，冻干备用。
1.5.4 离子交换层析 根据等电聚焦凝胶电泳结果，采用deaeff进一步除去非致敏蛋白。柱长15 cm，直径1.6 cm，用0.05 mol/l磷酸盐缓冲液（ph 6.4）充分平衡柱子，取经凝胶过滤层析收集的峰1透析、冻干蛋白质溶于缓冲液，使样品终浓度为12 mg/ml，8 000 r/min离心20分钟，取上清液进样。用0.6 mol/l氯化钠以1.2 ml/min的流速进行线性离子梯度洗脱，收集各峰样品透析、冻干备用。
1.5.5 将纯化所得的梭子蟹主要变应原通过western blot检测其免疫学活性 将离子交换收集的峰1依照文献［7］方法，通过sdspage电泳分离，电转移至pvdf膜上，用蟹过敏病人的血清做探针进行免疫反应，加羊抗人igehrp孵育，采用二氨基联苯胺（dab）显色。
2 结果
2.1 梭子蟹粗浸液蛋白成分的分析 梭子蟹粗浸液蛋白经sdspage分析，显示有19条可辨带，条带分布在13 000～90 000之间，其中主带有9条，分子量分别为20 900、24 200、27 100、29 200、33 700、38 900、48 700、74 700和89 100，见图1。
2.2 western blot鉴定梭子蟹致敏蛋白 取对蟹过敏的病人（26例）的血清作为一抗，同时取正常人血清（5号）作阴性对照，分别进行免疫印迹，26例病人血清（含特异性ige）均有阳性带出现，从图2可以看出浸出液中清晰可见的致敏带有5条，主要变应原组分是74 400、48 700，两条带都分别与26例蟹过敏患者血清特异性ige显阳性反应，阳性反应率均为100%，为梭子蟹主要变应原；分子量在89 100的大分子区带有8例病人血清有特异性ige反应，阳性反应率30%；33 700和29 200的蛋白带有1例病人血清（血清号是19418）有阳性反应，阳性反应率均为3.8%，为梭子蟹浸出液的次要变应原；而正常人血清则呈阴性反应，见表1。
图1 梭子蟹粗抽提液sdspage分离结果（考马斯亮兰染色）（略）
fig.1 sdspage analysis of sand swimming crab extract(stained by coomassie brilliant blue)
note:m.molecular mass standards;1.the crude crab extract.
图2 western blot鉴定梭子蟹致敏蛋白（略）
fig.2 immunostained western blot of sand swimming crab allergen
note:m.molecular mass standards(with masses given in kilodaltons);14.crab allergen reacted with crab allergen positive sera;5.crab allergen reacted with negative serum.
表1 通过western blot鉴定的梭子蟹致敏组分（略）
tab.1 identification of the allergic components of separated crab extract by western blot analysis
图3 梭子蟹sephadex g100凝胶层析图（略）
fig.3 separation of the swimming crab allergen by sephadex g100 gel chromatography
图4 梭子蟹1峰样品sdspage电泳图（略）
fig.4 sdspage of the components collected in the first peak from chromatography
图5 deaeff离子交换层析法纯化梭子蟹蛋白（略）
fig.5 purification of swimming crab allergen by deaeff ion exchange chromatography
2.3 sephadex g100凝胶过滤层析 梭子蟹浸出液透析、冻干粉，经sephadex g100凝胶过滤，结果出现2个蛋白峰，见图3。sdspage检测分析表明，主要变应原组分在峰1，其分子量在38 000以上，见图4。
2.4 deaeff离子交换层析 将sephadex g100凝胶过滤层析所得样品（峰1）透析、冻干，经检测后具有变应原活性的部分经deaeff离子交换层析，结果出现2个蛋白峰，见图5。sdspage检测分析表明，主要变应原组分在峰1，其分子量是74 400和48 700，见图6。
图6 梭子蟹致敏原纯化后sdspage电泳比较（略）
fig.6 sdspage analysis of the purified sand swimming crab allergen
note:1.the crude extract of swimming crab;2.the first peak collection of chromatography yield;3.the second peak collection of chromatography yield.
图7 梭子蟹分离纯化后的致敏蛋白western blot鉴定（略）
fig.7 western blot identification of the purified sand swimming crab allergen
note:m.molecular mass standards;1.the purified crab protein components reacted with crab allergen positive sera.
2.5 纯化后主要变应原的免疫活性 纯化后主要变应原组分：74 400和48 700的蛋白具有变应原活性，见图7。
3 讨论
根据国外对蟹变应原的研究报道，hefle等［4］采用雪蟹肉提取物与18个过敏血清标本反应，10例与分子量在25 000～45 000的蛋白条带特异性ige显阳性反应，5例与14 000或14 000以下的蛋白条带特异性ige结合，2例显示只与14 000的条带和2例显示只与97 000的条带发生特异性ige结合，而有5例则显示与38 000～41 000的单条蛋白带反应。leung等［3］报道，分子量为34 000的蛋白是蟹中第一个被鉴定的主要变应原。我们鉴定的主要变应原组分是74 400和48 700的蛋白质；次要变应原组分的分子量为89 100、33 700和29 200。各实验室结果不一致，可能是由于蟹种和人种的差异引起的。由于蟹的种类不同，所以有必要对不同种类的蟹进行深入研究，以得到针对不同种类的标准化的蟹变应原制剂。
从sdspage与western blot两实验结果比较分析，我们发现sdspage实验分离到的蛋白含量高的条带与患者血清中蟹变应原特异性ige结合率并不一定高，如33 700的蛋白条带在26例病人中，只有1例与蟹变应原特异性ige结合。
蟹是引起过敏的最常见的海产品之一，目前国内临床上进行体内外变应原检测所用的变应原只是经脱脂后的粗浸液，其内含有多种蛋白组分，其中包括主要、次要变应原组分和其他非特异性蛋白成分，由于未进行纯化和标准化，批间差异大，影响临床诊断的准确性，甚至发生严重的不良反应，因此我国目前迫切需要研制出具有本国及本地区特色的标准化蟹变应原，以提高体内和体外检测诊断的准确性和安全性。梭子蟹的主要变应原成分代表其主要的致敏成分，所以对其进行纯化具有重要的临床意义。本文选用梭子蟹进行分离纯化，获取梭子蟹天然的主要变应原，同时对其变应原特性进行鉴定，为标准化变应原疫苗的研制提供理论依据，以探讨对变态反应疾病更安全、更准确的诊断方法。
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