阿加曲班对大鼠肢体缺血再灌注损伤肠系膜微循环影响的实验研究
【关键词】 缺血再灌注损伤; 选择素; icam1;微循环; 阿加曲班
【摘要】 目的 探讨阿加曲班对大鼠肢体缺血再灌注损伤肠系膜微循环的影响，为缺血再灌注损伤的防治提供新的思路。方法 采用大鼠肢体缺血再灌注模型，将14只wistar大鼠随机分为每组7只：对照组和阿加曲班组，每组7只。2组大鼠均于再灌注2 h后，酶联免疫吸附（elisa）法测定血浆p选择素、细胞间粘附分子1（icam1）浓度；应用bi2000医学图像分析系统观察和记录肠系膜微循环改变，指标包括肠系膜微动脉管径（ad）和微静脉管径（vd）、肠系膜微动脉血流速度（afv）和微静脉血流速度（vfv）以及白细胞粘附情况。结果 大鼠肢体缺血再灌注2 h后，阿加曲班组血浆p选择素浓度、血浆icam1浓度显著低于对照组（p>0.05）。与对照组相比，阿加曲班组肠系膜微循环障碍较轻，ad和vd与对照组之间差异无统计学意义（p>0.05），afv和vfv明显高于对照组（p＜0.05），白细胞粘附较对照组轻（p＜0.05）。结论 阿加曲班能够降低血浆p选择素和icam1浓度，进而改善大鼠肢体缺血再灌注损伤时的肠系膜微循环障碍。
【关键词】 缺血再灌注损伤; 选择素; icam1;微循环; 阿加曲班
the effects of argatroban on mesentery microcirculation in rats with limb ischemia/reperfusion
du liqing,bi shijun,kong xiaoyan.
fengrun district people’s hospital of tangshan city,hebei,tangshan 064000,china
【abstract】 objective to observe the effects of argatroban on mesentery microcirculation in rats with limb ischemia/reperfusion injury in order to provide a new way for the prevention and treatment of ischemia/reperfusion injury. methods 14 wistar rats were randomly divided into control group and agatroban group, 7 rats in each group. the rat models of limb ischemia/reperfusion injury were established.the levels of plasma pselectin and plasma icam1 were detected by enzyme linked immunosorbent assay(elisa) at the point of 2h after reperfusion.the bi 2000 medical analysis system was used to observe the changes of mesenteric microcirculation.the microvascular arteriole diameter(ad), microvascular venule diameter(vd), arteriole flow velocity(afv), venule flow velocity (vfv) and the number of adhesive leukocytes were detected.results after 2hour reperfusion,the levels of plasma pselectin and plasma icam1 in agatroban group were significantly lower than those in control group (p<0.05). as compared with control group, mesenteric microcirculation disturbance in agatroban group was lighter,however,there was no significant difference in ad,vd between agatroban group and control group (p>0.05).the afv and vfv in agatroban group were significantly higher than those in control group (p<0.05),and the leukocyte adhesion in agatroban group was lighter than that in control group (p<0.05).conclusion agatroban can reduce the concentrations of plasma pselectin and plasma icam1 so as to improve mesenteric microcirculation disturbance in limb ischemia/reperfusion injury of rats.
【key words】 ischemiareperfusion injury;microciuculation; argatroban; pselectin; icam1
缺血再灌注损伤不仅影响缺血组织的存活及功能，而且可通过炎性细胞的激活、多种炎性介质及细胞因子的产生和释放，引发全身炎性反应综合征，导致远隔器官的结构损伤和功能障碍，严重时可引发多器官功能不全综合征而危及患者生命。Www.11665.COm近几年随着对缺血再灌注损伤基础研究的深入，对其再灌注损伤的保护研究也越来越多，试图应用不同的方法，通过不同的途径发挥作用。缺血预处理、抗氧化疗法、抗白细胞疗法等，都有很好的保护作用［1-4］。阿加曲班是化学合成的低分子药物,直接与凝血酶的催化活性位点结合,灭活凝血酶。近年研究表明阿加曲班还抑制凝血酶的其他作用，如可以抑制肿瘤转移、炎症过程及血管成形术后的再狭窄等［5］，对微循环障碍和血液流变性也有一定影响［6］。我们应用阿加曲班对大鼠肢体缺血再灌注损伤进行实验研究，观察对肠系膜微循环的影响，为缺血再灌注损伤的临床防治提供取基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性wistar大鼠，体重（250±20）g，购自河南医科大学实验动物中心。自由饮水、进食，室温（25±2）℃，分笼饲养。
1.2 动物模型的制备
大鼠于术前12 h禁食，自由饮水。沿大鼠双后肢根部用止血带结扎，完全阻断血流；阻断4 h后松解止血带，恢复双后肢血流。用与bi2000 医学图像分析系统连接的微循环显微镜观测肠系膜微循环的动态变化，并记录结果。自大鼠腹主动脉放血处死动物，血液用做检测血液流变学及血浆p选择素和细胞间粘附分子1(intracellular adhension molecule1, icam1)浓度等相关指标。
1.3 动物分组
实验大鼠14只，随机分为2组,每组7只：阿加曲班组缺血4 h，于再灌注前30 min给予阿加曲班5 mg/kg腹腔注射。对照组大鼠单纯肢体缺血4 h后再灌注，再灌注前30 min给予等量0.9%氯化钠溶液腹腔内注射。2组动物均于再灌注2 h后观察肠系膜微循环改变。
1.4 微循环观察
采用bi2000医学图象分析系统，进行肠系膜微循环的动态观察。应用显微电视法［7］测定微动脉管径（ad）和微静脉管径（vd），采用光点同步扫描法［8］测定微循环血流速度，即微动脉流速(afv)和微静脉流速（vfv）。将附壁不再滚动时间超过30 s的白细胞定义为粘附的白细胞，选择无分枝、长100 μm、正常状态下白细胞粘附数少于3个的微静脉进行观察，计数粘附在内皮上的白细胞数目，进行记录。每只动物记录3条微静脉的白细胞粘附情况，取平均值。
1.5 elisa法测定血浆p选择素、icam1浓度
血标本均置于含有抗凝剂edta的试管中，3 000 r/min离心15 min，将处理好的样品置于-70℃低温冰箱内保存。样本统一测定，严格按照试剂盒说明操作。elisa试剂盒购自天津灏洋生物制品公司。
1.6 统计学分析
应用spss 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用wilcoxon法的q检验，p＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 2组动物肠系膜微循环的变化
对照组再灌注2 h时，肠系膜ad和vd扩大（表1，图1），微血管壁增厚，血流速度减慢，细静脉呈粒流或粒缓流，并可见无复流现象，红细胞聚集和白细胞附壁翻滚、粘附明显（图1），白微栓形成较少。阿加曲班组上述变化较轻，血管壁略增厚，呈线粒流，无复流现象少见，白细胞有贴壁滚动现象多，但粘附少见（图2）；肠系膜ad与对照组之间差异无统计学意义（p=0.21）；vd与对照组差异无统计意义（p=0.69）；afv与对照组比较差异有统计学意义（p=0.20）;vfv与对照组比较差异有统计学意义（p=0.009）；白细胞粘附与对照组相比，显著少于对照组（z=-1.995，p=.046）。见表1、2。 表1 2组肠系膜微循环变化比较（略）注：与对照组比较，*p<0.05,#p<0.01
表2 2组白细胞粘附情况比较（略）注：与对照组比较，*p<0.05
2.2 2组血浆p选择素和icam1浓度比较
阿加曲班组血浆p选择素和icam1浓度与对照组比较差异有统计学意义（p=0.027和0.017）。见表3。表3 2组血浆p选择素与icam1浓度比较（略）注：与对照组比较，*p<0.05
3 讨论
缺血再灌注损伤的发生机制错综复杂，大量的研究表明，活性氧代谢产物、钙超载、微循环障碍、血液流变性改变和凝血酶的激活等是导致该损伤的主要机制［9］。在缺血再灌注时，机体的凝血活性增强主要是由于直接内皮细胞损伤和各种细胞因子促进内皮细胞表达各种粘附分子，例如e选择素、p选择素和icam1［10］；内皮损伤使内皮下的组织因子入血，另一方面，单核细胞和内皮细胞生成组织因子增加［11］。粘附分子和组织因子分别从内源性途径和外源性途径激活了凝血系统，其后果是使纤维蛋白原转变为纤维蛋白，甚至导致微循环中广泛的微血栓形成。
微血栓的形成会增加血粘度，堵塞微血管，进一步加重和微循环障碍和血液流变性异常。更重要的是，凝血过程会通过多种方式促进炎症发展，比如活化的因子ⅹ（fⅹa）可以诱导内皮细胞表达细胞因子和粘附分子。更能把凝血过程和炎症过程紧密地联系在一起的是凝血酶(因子ⅱa)，体外试验显示它能诱导单核细胞和中性粒细胞趋化［12,13］，诱导内皮细胞表达粘附分子［14］，诱导中性粒细胞粘附［15］。凝血酶还能强力激活血小板，并促进血小板介导的中性粒细胞和内皮细胞之间的粘附［16］。体内体外试验均表明，fⅹa和凝血酶还能促进中性粒细胞和内皮细胞等细胞表达细胞因子［17,18］。微循环障碍、血液流变性改变和凝血系统的激活，三者互为因果，相互影响，从而形成恶性循环，导致微循环缺血、瘀血、无复流，直接影响组织、器官的血液灌注和代谢，加重缺血再灌注损伤。
其作用特点为: （1）直接灭活凝血酶(因子ⅱa)的活性［19］,其作用不依赖于抗凝血酶; （2）不但灭活液相凝血酶,还能够灭活与纤维蛋白血栓结合了的凝血酶; （3）阻断凝血瀑布的正反馈,间接抑制凝血酶的产生; （4）治疗剂量下对血小板功能无影响,不导致血小板减少症; （5）具有良好的剂量－反应关系,效果和安全性可以预测; （6）与活化部分凝血活酶时间(aptt)或者活化凝血时间(act)相关性良好。阿加曲班可通过抑制凝血酶催化或介导的反应并且激活天然的抗凝剂蛋白c从而发挥其药理学作用［20］。阿加曲班在体外就能降低血粘度，并且呈现s曲线，有剂量依赖效应［21］。
本实验通过观察大鼠肠系膜微循环的情况，阿加曲班显著降低p选择素和icam1的血浆浓度，白细胞的贴壁、缓慢翻滚、粘附减轻。（1）证明阿加曲班能够改善肠系膜的微循环，促进肠道功能的恢复。（2）利用大鼠肠系膜微循环的容易观察性，间接反映其他脏器的微循环。
阿加曲班可以有效改善改善肢体缺血再灌注时的肠系膜的微循环状态，分析原因主要有2点：（1）降低血浆p选择素和icam1浓度，减少白细胞粘附，从而减轻全身炎性反应。（2）直接灭活凝血酶(因子ⅱa)的活性，避免进一步促进凝血作用的级联反应,防止微血栓形成。因此阿加曲班表现出对缺血再灌注损伤的保护作用。
【参考文献】
1 孙君志，苏全生.骨骼肌缺血再灌注损伤机制及其防治进展.四川体育科学，2006，12：4650.
2 kin h，zhao zq，sun hy，et al.postconditioning attenuates myocardial aschemia reperfusion injury by inhibiting evens in the early minutes of repefusion.cardiovasc res,2004,62:7485.
3 halkos me，kerendi f，corvera js，et al. myocardial protection with postcondioning is not enhanced by ischemic precondioning.ann thorac surg,2004,78:961969.
4 戚伟，陈克俊，阚世廉，等.缺血后处理对大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的影响.中华手外科杂志,2009,25:121123.
5 张子彦.阿加曲班研究进展.国际内科学杂志,2007,34:483485
6 hitosugi m, niwa m, takatsu a. changes in blood viscosity by heparin and argatroban. thromb res, 2001,104:371374.
7 符庆瑛，李著华，张艳青，等. 兔肾缺血再灌注损伤时肠系膜微循环和血液流变性变化及pgi2的影响. 中国血液流变学杂志,2004,14:2529.
8 张钢，高钰琪.急性缺氧对大鼠肠系膜微循环白细胞流变学行为的影响.第三军医大学学报,2002,24:320322.
9 杨爱军.缺血再灌注损伤机制的研究进展.局解手术学杂志,1998,7：181183.
10 strieter rm, kunkel sl. acute lung injury: the role of cytokines in the elicitation of neutrophils. j invest med，1994,42:640651.
11 senden nh, jeunhomme tm, heemskerk jw, et al. factor xa induces cytokine production and expressionof adhesion molecules by human umbilical vein endothelial cells. j immunol,1998,161：43184324.
12 barshavit r, kahn a, wilner gd, et al. monocyte chemotaxis: stimulation by specific exosite region in thrombin.science,1983,220:728731.
13 zimmerman ga, mcintyre tm, prescott sm. thrombin stimulates the adherence of neutrophils to human endothelial cells in vitro. j clin invest, 1985, 76:22352246.
14 kaplanski g, marin v, fabrigoule m, et al.thrombinactivated human endothelial cells support monocyte adhesion in vitro following expression of intercellular adhesion molecule1 (icam1; cd54) and vascular cell adhesion molecule1 (vcam1; cd106). blood, 1998, 92:12591267.
15 kaur j, woodman rc, ostrovsky l, et al. selective recruitment of neutrophils and lymphocytes by thrombin: a role for nfkappab. am j physiol heart circ physiol, 2001, 281:784795.
16 kupatt c, habazettl h, hanusch p, et al. c7e3fab reduces postischemic leukocytethrombocyte interaction mediated by fibrinogen. implications for myocardial reperfusion injury. arterioscler thromb vasc biol, 2000, 20:22262232.
17 yamaguchi y, okabe k, liang j,et al. thrombin and factor xa enhance neutrophil chemoattractant production after ischemia/reperfusionin the rat liver. j surg res, 2000, 92: 96102.
18 shinohara t, suzuki k, takada k , et al. regulation of proteinaseactivated receptor 1 by inflammatory mediators in human vascular endothelial cells. cytokine, 2002,19: 6675.
19 weitz ji, leslie b, hudoba m. thrombin binds to soluble fibrin degradation products where it is protected from inhibition by heparinantithrombin but susceptible to inactivation by antithrombinindependent inhibitors. circulation, 1998, 97:544552.
20 罗承锋.阿加曲班的药理作用与临床应用.血栓与止血学,2007,13:185192.
21 hitosugi m, niwa m, takatsu a. changes in blood viscosity by heparin and argatroban. thromb res, 2001,104:371374.
