【关键词】 贺菌食物中毒 分离株型别
志贺菌传统分型方法主要是生化鉴定、血清学和噬菌体分型等，由于志贺菌的血清型别与部分大肠埃希菌存在交叉凝集，因此,无法体现暴发菌株间的遗传信息。为了探讨用于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查的适宜技术，本研究采用脉冲场凝胶电泳(pfge) 方法〔1〕，对1起由宋内志贺菌引起幼儿园食物中毒中的菌株进行了分子流行病学分析。现将结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 对象 甘肃省武威市实验幼儿园食物中毒发病并住院治疗儿童307例，采集患儿粪便标本158份；采集幼儿园和患儿所住医院环境标本和幼儿园食堂剩余原料生猪肉标本39份；未采集到烹调加工后的食物标本（未留样）。
1.2 方法
1.2.1 菌株来源 （1）散发病例分离株:2株（菌株号gs0768、gs0787）分离自武威市凉州区国家监测点2007年8月散发病例；（2）食物中毒分离株：62株均为本次食物中毒分离株，其中患儿粪便标本分离株61株，食物原料标本分离株 1株。所有菌株经鉴定均为宋内志贺菌。（3）参考菌株：沙门菌h9812（中国疾病预防控制中心传染病所），为全国病原细菌实验室监测网络pulsenet china中的标准菌株。www.11665.coM
1.2.2 主要仪器与试剂 chef driii型脉冲场电泳仪、quantity one(4.4.0)凝胶成像系统(美国bio-rad公司)；细菌浊度仪biomerieux vitek colorimeter、seakem gold 胶(美国cambrex公司)；蛋白酶k（merck）、限制性内切酶 xbai(大连宝生物工程有限公司)。
1.2.3 pfge分型 根据文献〔2〕方法进行pfge分型，略有改动：取新鲜琼脂培养物到1 ml细胞悬液a550比浊，吸光度为1.0～1.2。于400 μl菌悬液加入20 μl蛋白酶k（20mg/ml）,再与等体积低溶点琼脂混合，灌制胶块。用50 μg/ml蛋白酶k液消化2 h。分别用15 ml纯水和三羟甲基氨基甲烷-乙二胺乙酸二钠(te；10 mmol/l tris:1 mmol/l乙二胺四乙酸,ph 8.0) 洗胶块2和4次，消化和洗涤均在54 ℃摇床130 r/min中进行。然后切2 mm胶块加入195 μl酶切缓冲液中,再加入5 μl限制性内切酶xbaⅰ，37 ℃酶切2 h。将胶条包埋于1% seakem gold琼脂糖。chef driii电泳仪电泳。电泳温度为14 ℃,电压6 v，夹角120°，脉冲时间2～18 s，电泳18 h。溴化乙锭染色，凝胶图像分析系统记录和肉眼观察分析pfge图谱。
1.3 统计分析 采用bionumerics 4.6软件进行处理，聚类图类型运用非加权配对数学平均法(upgma)构建，采用dice系数衡量pfge带型之间的相似度。
2 结 果
2.1 基本情况 调查结果显示，所有患儿发病集中在3 d内，以发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等消化道症状为主；发病儿童有2次共同食用宋内志贺菌污染的食物原料生猪肉烹制的菜肴，导致439名就餐儿童中有307名儿童发病。采集患儿粪便标本158份，检出宋内志贺菌61株，检出率达27.85%；采集患儿所住医院环境标本38份，未检出致病菌；采集幼儿园食堂剩余原料猪肉标本39份，检出宋内志贺菌1株。
2.2 聚类分析 用xbai酶切后, 64株分离菌株可分为7个pfge带型，分别是xbai001～xbai007。其中xbai001型46株，占测试菌株71.88%，均为本次食物中毒分离株，其中包括食物原料生猪肉分离株1株；xbai004型11株，占测试菌株的17.19%；xbai003型3株，其中1株为散发病例分离株（gs0787），带型与其他2株相同，占测试菌株的4.68%；另有4种带型各1株，分别为xbai002型、xbai005型、xbai006型和xbai007型，相互之间的相似性差别较大。
2.3 部分pfge电泳图谱(图1) 图1可见，此次食物中毒患儿粪便分离株大部分与可疑食物（生猪肉）分离株同属于xbai001型，为本次测试菌株的主要型别；另有部分患儿分离株同为xbai004型；少部分患儿粪便分离株与散发病例分离株同属于xbai003型；患儿粪便分离株还检出xbai002型、xbai007型和xbai006型。注：m：参考菌株；暴发分离株中：1，10，20分别为xbai002型、xbai007型和xbai006型；3，4为xbai003型；5～9、12～14、16～19均为xbai001型；11，15，22均为xbai004型；2：散发分离株，xbai003型；21：生猪肉分离株，xbai001型。
3 讨 论
脉冲场凝胶电泳(pfge) 分型技术因其结果能反映菌株全基因组遗传学特征,是目前分子生物学技术除基因测序外在重复性、特异性、分辨力、准确度上非常理想的方法之一，尤其对于分析亲缘关系、追踪传染来源具有独特的优势,pfge分型已经广泛应用于分析不同来源菌株是相关的暴发还是无关联的散发〔3,4〕。但对pfge结果的分析存在人为因素，可因不同研究者而出现一定差异，目前主要以tenover等〔5〕提出的菌株同源性判别为标准，按其pfge电泳条带分为：无差异，说明为相同菌株；有1～3条带有差异说明菌株间有相近关系，且只有单基因的改变；4～6条带有差异说明菌株间可能有相近关系，表示有2个独立基因的差异。
本文结果显示，此次食物中毒患儿粪便分离株以xbai001型和xbai004型为pfge分型的优势型别，前者与可疑食物的原料生猪肉分离株属同一型别，并且占分析菌株的71%。结合流行病学调查结果，推断此次食物中毒主要由食物原料之一生猪肉受到宋内志贺菌污染，制作菜肴时未熟透所致。另有11株患儿分离株同为xbai004型，推测幼儿园儿童中可能存在宋内志贺菌感染病例，经密切接触或污染食物或玩具而引起暴发。xbai003型有3株分离株，其中1株为散发病例分离株（gs0787），此次感染病例是否与相隔近1个月的散发病例有关，需要进一步观察。其他4个pfge带型病例是否与此次食用带菌猪肉加工的饭菜有直接关系，还是感染后因个体免疫状态、使用抗生素等作用产生菌株变异，有待于进一步证实。
【参考文献】
1〕 swaminathan b,barrett tj,hunter sb,et al.pulsenet:the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance ,united states［j］.emerg infect dis,2001,7:382-389.
〔2〕 cooper kl,luey ck,bird m,et al.development and validation of a pulsenet standardized pulsed-field gel electrophoresis protocol for subtyping of vibrio cholerae［j］.foodborne pathog dis,2006,3:51-58.
〔3〕 汪皓秋,潘劲草,孟冬梅,等.杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型［j］.中国公共卫生,2007,23(3):369-370.
〔4〕 刘红露，张京云，冯泽惠，等.脉冲场凝胶电泳分型技术在追溯o139霍乱传染来源中的应用［j］.中华流行病学杂志，2006，27：104-105.
