作者：张树恒 衣服新 倪伟民 孟飞 叶志军
【摘要】 目的 研究水通道蛋白4在出血性脑损伤大鼠脑内的表达,及丝裂原活化蛋白激酶 (mapks)信号转导通路阻滞剂u0126对其表达的影响。方法 大鼠缓慢注射自体血出血模型,测定脑组织含水量及伊文斯蓝含量,并采用免疫组织化学，western blot检测aqp4的表达。测定预先经尾静脉给予u0126后mapks信号通路关键蛋白erk1/2磷酸化水平,同时观察u0126对脑水肿和aqp4表达的影响。结果 假手术组aqp4表达较低，在出血损伤后表达升高,脑组织含水量及伊文斯蓝含量增加,给予u0126后aqp4的表达和脑组织含水量降低,同时erk1 /2磷酸化水平降低。结论 出血性损伤后aqp4表达上升,脑水肿明显,预先给予u0126可抑制aqp4的表达,减轻脑水肿。
【关键词】 脑出血 脑水肿 水孔蛋白类 丁二烯类 腈类
对于脑水肿的形成,传统观念认为是由于能量耗竭和钙超载所致, 但最近研究发现,aqp4（aquaporin-4,)起着重要作用[1]。水通道蛋白(aqp)是近年来发现的一类涉及特异性细胞膜水分子转运蛋白，是影响水跨膜转运和细胞内外环境平衡调节的主要膜蛋白[2]。wWw.11665.COMaqp家族有十多种类型,其中aqp4主要分布于中枢神经系统,与脑脊液重吸收、渗透压调节、脑水肿形成等生理和病理过程密切相关[3]。我们于2007年9月至2008年7月通过给予mapks抑制剂u0126,研究其对实验性出血性脑损伤大鼠的脑水肿及aqp4表达的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物和主要试剂 72 只健康雄性sd大鼠(200～250 g)由辽宁医学院实验动物中心提供。p-erk1/2抗体,购自美国santa cruz公司，aqp4抗体试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 动物分组和模型制备及药物处理 用随机排列表法分入4 组:假手术组，出血组，载体溶液对照组，载体溶液加u0126组,每组各18 只。
u0126用药方法 称重大鼠并以0.1 mg/kg体重计算u0126(1，4-二氨基-2，3-氰基-1，4-双[2-氨基苯基硫代]丁二烯)用量，将u0126溶解于dmso中并以0.1 mmol/l的pbs稀释为总量 300 μl。于造模前30 min自尾静脉注入。相同dmso含量的pbs溶液300 μl尾静脉注射作为载体溶液对照。假手术组和脑出血组在造模前相同时间点自尾静脉注入等容量量生理盐水。
采用大鼠缓慢注射自体血出血模型，依照gieorge paxinos大鼠脑立体定位图谱[4]经立体定位仪介导将取自股动脉的自体75 μl新鲜全血用微量注射针缓慢注入右侧尾状核。以动物出现不能完全伸展对侧前爪或向外侧划圈或向对侧倾倒作为模型成功的判断标准。假手术组，按上述方法进针，但不注血。各组均于造模后24 h断头取材。
1.3 脑组织含水量测定 各组取6只大鼠用于含水量的测定,采用干湿法,于出血侧前缘取脑组织约100 mg,称取湿重,于85 ℃烘烤后称取干重,计算含水量: 脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。
1.4 伊文斯蓝含量的测定 各组另取6只大鼠以其右侧半球病灶前半部分用于伊文斯蓝含量的测定,采用甲酰胺浸泡法,于股静脉注入2.5%伊文斯蓝盐水液0.2 ml/100 g体重,断头取脑后加入10%三氯醋酸沉淀蛋白,用无水乙醇匀浆,提取伊文斯蓝,取上清液在600 nm测定吸光度。绘制标准曲线测出伊文斯蓝含量(μg/g湿重)。
1.5 免疫组织化学 各组取6只大鼠,取出血灶周围脑组织,冠切制作4 μm石蜡切片,用两步法进行染色。
1.6 western blot 检测 各组取6只大鼠以其剩余右侧半球病灶后半部分用于蛋白印记检测。出血灶周围脑组织100 mg,提取总蛋白。sds-page凝胶电泳,半干法转膜,aqp4一抗(1∶500)、p-erk1/2一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶1 000) 37 ℃孵育1 h。ecl光化学法显色,用gelwork 4.0图像分析系统测定吸光度。
1.7 统计学方法 所测数据以x±s表示，以spss15.0统计软件，采用单因素方差分析的lsd法进行统计处理。
2 结 果
2.1 脑组织含水量和伊文斯蓝含量 与假手术组相比,其余各组脑组织含水量及伊文斯蓝含量明显增加,差异有统计学意义（p< 0.05)。出血组含水量载体溶液对照组高于u0126组，p< 0.05。出血组伊文斯蓝含量载体溶液对照组高于u0126组，p< 0.05,而出血组和载体溶液对照组差异无统计学意义(p< 0.05，见表1）。表1 脑组织含水量和伊文斯蓝含量结果
2.2 免疫组织化学结果 aqp4阳性染色位于星形胶质细胞、室管膜细胞和血管间隙,神经元为阴性,海马区表达强度高于皮质。出血组和载体溶液对照组及u0126组表达强度明显高于假手术组,而u0126组表达少于出血组和载体溶液对照组(图1～4)。p-erk1/2阳性染色位于胞核、胞质和突起，以胞核为主。在出血周围的皮质、深部皮质与脑白质结合部，及海马区染色较强，室管膜细胞和脉络丛血管内皮细胞也呈较强阳性染色。p-erk1/2在假手术组染色较少,出血损伤后(出血组和载体溶液对照组以及u0126组)阳性着色增多，u0126组表达少于出血组和载体溶液对照组。
2.3 western blot检测结果 aqp4条带(31kd)在假手术组较淡(吸光度值为124.2 ±1.1)， 出血组和载体对照组以及u0126组条带明显增宽变深。出血组aqp4吸光度值(156.8 ±0.8)和载体溶液对照组吸光度值（157.2 ±0.9）高于u0126组(147.7 ±1.2, p<0.01)。p-erk1/2为两条条带(42 kd和44 kd)，假手术组条带较淡,吸光度值(131.6 ±5.1)，且44 kd条带不明显,出血组和载体溶液对照组以及u0126组条带明显增深变宽,p-erk1/2条带吸光度值出血组（175.4 ±8.3 )和载体溶液对照组（174.5 ±6.7）低于u0126组(142.1 ±2.9,p<0.01)，出血组与载体对照组之间差异无统计学意义（p<0.05）。
3 讨 论
脑出血后除血肿直接破坏脑组织和占位效应引起神经损伤外，脑水肿是造成继发性神经损伤、病情恶化的重要原因之一。因此,预防和消除脑水肿是治疗出血性卒中的关键。但是目前尚缺乏针对脑水肿形成机制的有效药物。
水通道蛋白4的发现使人们在认识脑水肿形成的分子机制上跨出了历史性的一步。aqp家族有十多种类型,其主要功能是转运水。其中aqp4主要存在于脑,是胶质细胞与脑脊液以及血管之间的水调节和转运的结构基础,在脑组织水平衡和脑水肿的形成中发挥着重要作用[4]10-14。有研究显示,敲除水通道蛋白4基因的小鼠脑损伤后脑水肿较对照组明显减轻[5]，且大鼠脑出血后aqp4mrna和蛋白均增加,与脑水肿的形成成正相关[6]。可以推测有效抑制aqp4的表达,将会减轻脑水肿。
在本实验中,经检测,出血组大鼠脑组织含水量和伊文斯蓝含量均高于假手术组,提示脑出血后形成了脑水肿。同时,免疫组化和western blot检测均发现,出血损伤后aqp4的表达增加,这可能是脑水肿形成的原因之一。并且出血损伤后p-erk1/2表达亦明显升高，提示脑出血后mapks信号转导通路被激活,在脑出血过程中该通路在传递损伤信号,调控细胞对出血性损伤刺激的生物反应方面可能发挥着重要作用。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, mapks)是细胞内的一族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是细胞应激和损伤反应的主要信号通路,可将胞外刺激信号传递至胞核[7] 。迄今为止，真核生物细胞中已经发现5条mapk信号转导通路：erk/p42 /p44、sapk、p38和erk3／4和bmk亚家族,每个亚家族又分若干亚型，分别在不同的器官发挥不同的作用，其中, erk/p42 /p44通路主要存在于肌肉和脑[8] ,包含2个亚型: erkl和erk2,相对分子质量分别为42 kd和44 kd。损害性刺激信号作用于细胞表面的受体,激活 gtp 结合蛋白ras， 继而激活raf-1,raf-1可将mek磷酸化激活, 活化的mek (p-mek)可使erk1 /2被磷酸化形成p-erk1 /2,并向细胞核内转移,通过磷酸化下游的elk，使其获得调控转录的能力,调节与细胞损伤有关的即刻早反应基因和晚反应基因的表达[9]。
我们的实验，通过提前注射u0126来阻断脑出血损伤后mapks的信号转导。u0126是高选择性和高效的mapks阻滞剂,通过直接抑制mek活性而阻滞其下游分子erk1 /2的磷酸化[10]。实验结果显示注射u0126 后p-erk1 /2明显降低,提示在实验动物体内erk/p42 /p44 通路被阻断。与此同时, 给药组aqp4蛋白的表达也降低, 并且给药组的脑水含量亦明显降低，提示aqp4的表达受到erk信号通路的调控,阻断erk/p42 /p44信号通路可抑制aqp4的表达,从而减轻脑水肿。给药组伊文斯蓝含量也较出血组减少,这与aqp4 表达在星形胶质细胞与毛细血管内皮细胞接触的足突以及毛细血管内皮上, 即分布于bbb 的两侧, aqp4在介导水分子透过bbb 过程中扮演重要角色有关。本实验所采用高选择的mapks阻滞剂u0126可能为脑出血后脑水肿的治疗带来新的思路。应该看到调节细胞应激和损伤的各信号转导通路之间存在广泛的交联即所谓cross talk现象，十分复杂，因此进一步研究其它通路对aqp4表达的影响是十分必要的。（此文图1-4见第96页）
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